Свойства митохондриальной циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Ca2+-активируемой поры и ее возможная роль в активации апоптоза

• Автор: Белослудцев, Константин Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 93 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль митохондрий в регуляции С а2* гомеостаза клетки. Митохондриальные Са21'-транспортирующие системы
1.1.1. Митохондриальные системы входа Са2'
1.1.2. Митохондриальные системы выхода Са2+
1.2. Митохондриальные Са2+-зависимые поры
1.2.1. Циклоспорин А-чувствительная митохондриальная пора
1.2.2. Циклоспорин А-нечувствительная митохондриальная пора. Жирные кислоты как индукторы Са2^-зависимой ЦсА-нечувствительной поры
1.3. Апоптоз и некроз - два варианта клеточной гибели. Участие митохондрий в развитии клеточной смерти
1.4. Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение митохондрий из печени крыс
2.2. Оценка функциональных параметров митохондрий
2.3. Электронная микроскопия
2.4. Электрофорез и иммуноблотинг
2.5. Формирование однослойных липосом
2.6. Измерение проницаемости липосом, загруженных сульфородамином Б
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Открытие ЦсА-нечувствительной пальмитат/Са2*-активируемой митохондриальной поры зависит от Са^-связывающей способности пальмитиновой кислоты
3.2. Свойства пальмитат/Са2"-активируемой поры
3.2.1. Влияние циклоспорина А на пальмитат-активируемуто пору
3.2.2. Пальмитат/Са2'-активируемая пора обладает способностью самопроизвольно закрываться

3.3. Влияние известных модуляторов ЦсА-чувствительной поры, индуцируемой Са2+ и Р;, на пальмитат/Са2+-активтируемую пору
3.3.1. Влияние неорганического фосфата на пальмитат-активируемую пору
3.3.2. Влияние адениновых нуклеотидов на пальмитат-активируемую и ЦсА-чувствительную митохондриальные поры
3.3.3. Влияние М§2+ и Зг2* на пальмитат-активируемую пору
3.4. Открытие пальмитат/Са2+-индуцированной поры приводит к выходу из митохондрий цитохрома с
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений
ADP - аденозин-5’-дифосфат;
АТР - аденозин-5 ’ -трифосфат;
АМР - аденозин-5’-монофосфат;
Pi - неорганический фосфат;
ПК - пальмитиновая кислота;
ЦсА - циклоспорин А;
МРТ - mitochondrial permeability transition - классическая циклоспорин A-чувствительная митохондриальная пора;
ЭГТА - этиленгликоль - бис - (2-аминоэтиловый эфир) - N, N, N', N' -тетрауксусная кислота;
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;
Трис - трис-(оксиметил)аминометан;
ДНФ - 2,4-динитрофенол;
Hepes - N-2- гидроксиэтилпиперазин-Ы’-2-этансульфоновая кислота;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
' ДФ - разность электрических потенциалов на внутренней мембране
митохондрий,

Рис.10. Аккумуляция Са2+ митохондриями в отсутствие (/) и в присутствии (2) 1 мМ Pj. Среда инкубации как на рис. 3 и дополнена 1 мкМ ЦсА. Добавки: 150 нмоль Са2+/мг белка.
3.3.2. Влияние адениновых нуклеотидов на пальмитат-активируемую и ЦсА-чувствительную митохондриальные поры
Способность адениновых нуклеотидов ингибировать открытие ЦсА-чувствительной митохондриальной поры известна: давно (Hunter and Haworth, 1979а). В наших экспериментах было исследовано влияние адениновых нуклеотидов (ADP и АТР) на открытие ЦсА-нечувствительной поры, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са2 Нуклеотиды добавляли к митохондриям за 1 мин до внесения индукторов открытия поры - пальмитиновой кислоты и Са2+ для открытия ЦсА-нечувствительной поры и Ca2t с КН2Р04 в случае ЦсА-чувствительной поры. Эксперименты проводили в присутствии олигомицина (2 мкг/мл).
Из рис. 11, а видно, что добавление 2 мМ ADP практически не влияет на набухание митохондрий, индуцированное пальмитиновой кислотой и Са2+. При этой- концентрации нуклеотида скорость набухания органелл снижается только на 15%. В то же время 2 мМ ADP полностью ингибирует ЦсА-чувствительное набухание митохондрий, индуцированное Са2+ (100 нмоль/мг белка) в присутствии в среде 1 мМ КН2Р04 (рис. 11,6).
АТР, как известно, является гораздо менее эффективным ингибитором классической ЦсА-чувствительной поры (Zoratti and Szabo,