Роль матриксного белка фибулина-5 в регуляции функциональных свойств урокиназы

• Автор: Капустин, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с.

рацкч л нвза, f?*e »«*> Я В п Я
Ul JSAtSiltMllt
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Структура и функции урокиназы
Структура урокиназы
Функции урокиназы
Глава II. Регуляция активности урокиназы
Регуляция экспрессии урокиназы
Постгрансляционные модификации урокиназы
Белки-регуляторы протеолитической и сигнальной функции урокиназы
Глава III Фибулин-5 - новый регулятор ремоделирования сосудов и тканей
Структурная организация семейства фибулинов
Структура и функции фибулина
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химические реактивы
Культуральные среды и пластик
Антитела
Рекомбинантная урокиназа
Рекомбинантный фибулин
Определение концентрации белка в пробах
Иммобилизация белков
Аффинная хроматография белков, связывающихся
с урокиназой без «ростового» домена
Секвенирование белков
Приготовление вектора pCMV-FBLN5
Сайт-направленный мутагенез
Получение химически компетентных клеток E.coli
Выделение плазмидной ДНК из E. coli
Культивирование и трансфекция культуры клеток
Аффинная хроматография и иммунопреципитация фибулина-5 из кондиционных сред
трансфецированных клеток линии СНО и НЕК293
Иммуноцитохимическое окрашивание клеток
Биотинилирование урокиназы
ДСН-электрофорез
Иммуноблотгинг
Лигандный блоттинг
Получение общего клеточного лизата
Измерение активности урокиназы
Зимография урокиназы
Твердофазный анализ связывания белков
Количественный метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в
реальном времени
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Выделение и идентификация белков, связывающих урокиназу
1-1. Поиск белка, связывающего урокиназу без «ростового» домена
1-2. Идентификация белка с кажущейся молекулярной массой 65 кДа методом масс-спектрометрии
2. Взаимодействие урокиназы и белка внеклеточного матрикса фибулина
2.1. Клонирование кДНК фибулина-5 и его экспрессия в клетках СНО

2.2 Прямое взаимодействие урокиназы и фибулина
2.3 Взаимодействие фибулина-5 с урокиназой на клеточной поверхности
2.4. Доменная специфичность взаимодействия урокиназы и фибулина
2.6 Фибулин-5 как возможный протеолитический. субстрат урокиназы
3. Влияние фибулина-5 на протеолитическую активность урокиназы
3.1 Влияние фибулина-5 на амидолитическую активность урокиназы и скорость активации плазминогена
3.2 Влияние фибулина-5 на активность урокиназы в клетках и тканях легкого
3.4. Влияние фибулина-5 на подавление активности урокиназы под действием РАІ
4. Влияние фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Взаимодействие урокиназы с интегрин-связывающими белком фибулином
2. Фибулин-5 участвует в регуляции протеолитической активности урокиназы
3. Фибулин-5 является ингибитором хемотактических свойств урокиназы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ЬРЄР фактор роста фибробластов
СИЕВ белок, связывающийся с цАМФ-зависимыми элементами
ЕвЕ эпидермальный фаісгор роста
ЕСРІІ рецептор эпидермального ростового фактора
Е]Ж киназа, регулируемая внеклеточным сигналом
РАК киназа фокальных контактов
РВБ эмбриональная бычья сыворотка
БРИЛ рецептор, подобный рецептору формил-пептида
ОБО «ростовой» домен урокиназы
§рЗ 3 О/шезаІіп гликопротеин 3 3 0/мегалин
НОР ростовой фактор гепатоцитов
ІЬ-ір интерлейкин I р
ШБ-у гамма- интерферон
ІШ крингл-домен урокиназы
ЬВЬ липопротеины низкой плотности
ЬМ¥ низкомолекулярная форма урокиназы
иіР/а,2-МК белок, родственный рецептору липопротеидов низкой плотности/рецептор аг-макроглобулина,
МАРК протеинкиназа, активируемая митогенами
МЬСК киназа легких цепей миозина
РАІ-1 ингибитор активаторов ллазминогена
РАІ-2 ингибитор активаторов плазминогена
РВОР тромбоцитарный фактор роста

Предполагается, что фибулин-5 участвует в фенотипической модуляции сосудистых ГМК (Коуа1 е! а1., 1999). Получены данные, свидетельствующие об антиангиогенном действии фибулина-5 на эндотелиальные клетки. Гиперэкспрессия фибулина-5 ингибирует тубулогенез эндотелиальных клеток и их инвазивную способность несколькими способами.
д тропоэласгин
интегрин
микрофибрилла Эластиновое волокно
КЛЕТКА МАТРИКС
тропоэласгин
фибулин-б
интегрин
Эластиновое
волокно
Рисунок 7. Участие Фибулина-5 в организации эластиновых волокон.
А - Микрофибриллы формируются на клеточной поверхности и состоят из фибриллина и гликопротеинов, содержащих ІІСВ последовательность. Тропоэластин секретируется клетками и откладывается на микрофибриллах. Это способствует эффективной полимеризации упорядоченных молекул тропоэластина путем образования ковалентных сшивок и созреванию эластинового волокна.
Б — Фибулин-5 действует подобно шаперону в формировании эластинового волокна. Фибулин-5 связывает молекулы тропоэластина через Са-ЕБС-подобные домены и связывает их с интеринами на клеточной поверхности через КС О последовательность в первом Са-ЕЕС-подобном домене. Молекулы тропоэластина на клеточной поверхности взаимодействуют с микрофибриллами, в результате чего происходит их полимеризация и формирование эластинового волокна.