Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз

• Автор: Кузнецова, Ирина Львовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 142 с. : ил.

Список сокращений
Глава 1. Структура боковых петель РНК и их чувствительность к расщеплению (Обзор литературы)
1.1. Основные элементы вторичной структуры РНК
1.2. Методы исследования структуры боковых петель в ДНК- и РНК-дуплексах
1.3. Структура боковых петель в составе РНК
1.3.1. Боковая петля, состоящая из одного основания
1.3.1.1 Структура однозвенных А петель, полученная с помощью ЯМР
и РСА
1.3.1.2. Структура однозвенной А петли в составе ДНК: РНК дуплекса
1.3.1.3. Расчетная конформация однозвенной А петли в составе дуплекса
1.3.2. Однозвенные G-содержащие петли
1.3.3. Однозвенные U-содержащие петли
1.3.4. Однозвенные С-содержащие петли
1.3.5. Структура петель, содержащих более одного нуклеотида
1.3.6. Влияние ионов Mg2* на структуру боковой петли
1.4. Изучение структуры РНК, содержащих петли, с помощью электрофореза в нативных условиях и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления (transient electric birefringence)
1.5. Термодинамические характеристики дуплексов, содержащих боковые петли
1.6. Чувствительность фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК к расщеплению
1.6.1. Зависимость стабильности РНК от геометрических параметров межнулеотидной связи
1.6.2. Расщепление РНК в боковых петлях
1.6.2.1. Расщепление боковых петель РНК ионами металлов
1.6.2.2. Расщепление искусственных боковых петель РНК конъюгатами олигонуклеотидов и комплексов металлов
Заключение
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и препараты

2.1.2. Плазмиды
2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК
2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды
2.1.5. Буферные растворы, использованные в работе
2.2. Методы
2.2.1. Гель-электофорез
2.2.1.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.1.2. Электрофорез в агарозном геле
2.2.2. Приготовление компетентных клеток
2.2.3. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК pSVK3M2
2.2.4. Выделение плазмидной ДНК (аналитический вариант)
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК (препаративный вариант)
2.2.6. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro
2.2.6.1. Получение линейной формы плазмиды
2.2.6.2. Амплификация фрагмента М2 РНК вируса гриппа
2.2.6.3. Очистка ПЦР-продукга
2.2.6.4. Транскрипция in vitro
2.2.6.5. Очистка РНК-транскриптов
2.2.7. Получение радиоактивно меченых препаратов РНК и олигонуклеотидов
2.2.7.1. Введение [32Р]-метки по З’-ОН группе TPHKphe
2.2.7.2. Введение [32Р]-метки по 5’-концу РНК
2.2.8. Пробинг вторичной структуры РНК в растворе
2.2.8.1. Пробинг вторичной структуры фрагмента М2 РНК вируса гриппа
2.2.8.2. Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях
2.2.8.3. Пробинг вторичной структуры мини-тРНК и комплексов М2-96 РНК: олигонуклеотид в имидазольном и метилимидазольном буферах
2.2.9. Пробинг дуплексов РНКюлигонуклеотид РНКазой Н
2.2.10. Пробинг дуплексов РНКюлигонуклеотид РНКазой А
2.2.11. Компьютерное моделирование вторичной структуры М2-96 РНК
2.2.12. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с М2-96 РНК методом задержки в геле
2.2.13. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами
2.2.14. Расщепление М2-96 РНК в комплексе с олигодезоксирибонуклеотидами с помощью химических рибонуклеаз
Глава 3. Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз (Результаты и обсуждение)

3.1. Рибонукпеазная активность коротких синтетических пептидов, состоящих из остатков лизина и гистамина
3.1.1. Дизайн химических рибонуклеаз серии п!.т
3.1.2. РНК-мишени
3.1.3. Зависимость эффективности расщепления РНК под
действием соединенийп!_т от длины и вторичной структуры субстрата
3.1.4. Специфичность расщепления РНК соединениями пЬт
3.1.5. Влияние концентрации соединений п!_т на их рибонуклеазную активность
3.1.6. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями п1_т
3.1.7. Механизм расщепления РНК соединениями пЬт
3.1.8. Сравнение рибонуклеазной активности соединений п1_т и АВЦкСт
3.2. Рибонуклеазная активность трипептидов, состоящих из аминокислот, входящих в состав активных центров природных рибонуклеаз А и Т1
3.2.1. Дизайн трипептидов
3.2.2. РНК-мишени
3.2.3. Изучение РНК-расщепляющей активности трипептидов
3.2.4. Специфичность расщепления РНК трипептидами
3.2.5. Влияние концентрации трипептидов на их рибонуклеазную активность
3.3. Рибонукпеазные свойства соединений на основе соединенных жестким линкером двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота
3.3.1. Дизайн соединений Охп
3.3.2. РНК-мишени
3.3.3. Расщепление ОИ21 соединениями серии Эхп
3.3.4. Концентрационные зависимости расщепления РНК соединениями

3.3.5. Кинетика расщепления РНК под действием соединений Охп
3.3.6. Специфичность расщепления РНК под действием соединений Охп
3.3.7. Влияние имидазола на РНК-расщепляющую активность соединения Ор12
3.3.8. Сравнение РНК-расщепляющей активности соединений серии Охп с соединением АВ1.4СЗ
3.4. Направленное расщепление РНК химическими рибонуклеазами по фосфодиэфирным связям в боковых петлях
3.4.1. РНК-мишень
3.4.1.1. Изучение вторичной структуры М2-96 РНК

2.2.6.5. Очистка РНК-транскриптов
Осадок РНК, содержащий трифосфаты после транскрипции, растворили в буфере для нанесения на гель, содержащий 8 М мочевину, 0.025%-ный бромфеноловый синий, 0.025%-ный ксиленцианол, и нанесли на 6%-ный денатурирующий ПААГ. Положение полосы РНК в геле определяли по поглощению УФ света (Я. = 254 нм), используя в качестве экрана пластину для тонкослойной хроматографии "ІІХ/и/ (Мегск, Германия). РНК элюировали из геля в 500 мкл 0.5 М ацетата аммония, содержащего 1%-ный БОБ в течение 4 ч, затем добавили 1.5 мл этанола и осадили при -гО'-’С в течение 10 - 12 ч. Осадок РНК отделили центрифугированием (14 ООО об/мин, 4°С, 10 мин, центрифуга “Соп^оп”), промыли 80%-ным этанолом, высушили и растворили в буфере ТЕ.
Концентрацию РНК определили спектрофотометрически. Чистоту и гомогенность препаратов РНК контролировали с помощью электрофореза в денатурирующем ПААГ.
2.2.7. Получение радиоактивно меченых препаратов РНК и олигонуклеотидов
2.2.7.1. Введение [32Р]-метки по З'-ОН группе тРНКр>,е
Введение 32Р-метки по З’-концу тРНКРЬе проводили по методу [136]. Стандартную реакционную смесь объемом 15 мкл, содержащую 0,1 о.е. А26о тРНКрг'е, буфер Ц 20 мБк [5’-32Р] цитидин-3’,5’-дифосфата и 20 ед. акт. Т4 РНК-лигазы, инкубировали при 4°С в течение 18 часов. По окончании инкубации к реакционной смеси добавили равный объем 8 М мочевины и нанесли на 10%-ный денатурирующий ПААГ. По окончании электрофореза полосу меченой тРНКр,1е вырезали, РНК из геля элюировали 3 раза по 300 мкл 0.3 М ацетатом натрия, pH
5.5, осадили этанолом по стандартному протоколу (Раздел 2.2.3.1). Осадок растворяли в воде и хранили при -20°С. Препараты тРНКр,1е имели удельную активность 1 - 5-Ю5 имп/(мин пмоль).
2.2.7.2. Введение [32Р]-метки по 5-концу РНК
Мечение РНК проводили по модифицированной методике [137]. РНК предварительно дефосфорилировали с помощью бактериальной щелочной фосфатазы (ВАР). Для этого смесь объемом 50 мкл, содержащую 10 мкг тРНК, 50 мМ Трис-НСІ, pH 8.0, 2%-ный формамид, 0.2% БОБ последовательно инкубировали 2 мин при 60°С и 1 мин при 0°С. Затем добавили ОТЕ до 2.5 мМ, 0.4 е.а. РНКазина, перемешали и добавили 0.6 ед.акт. ВАР, инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Через 30 мин повторно добавили 0.6 ед.акт. ВАР и вновь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. По окончании инкубации реакционную смесь последовательно