Свойства митохондриальной креатинкиназы мозга в условиях ишемии и интервального гипоксического прекондиционирования

• Автор: Колчина, Наталья Станиславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 0 с. : 170 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Креатинкиназная система клетки и её функция в энергетическом
метаболизме
2. Нарушение структуры и функции мембран митохондрий мозга при острой
ишемии
Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава П1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Свойства митохондриальной креатинкиназы мозга интактных животных
2. Свойства митохондриальной креатинкиназы мозга крыс в динамике острого нарушения мозгового кровообращения
3. Свойства митохондриальной креатинкиназы мозга при интервальном гипоксическом прекондиционировании и в условиях острой 30-ти минутной ишемии у адаптированных животных
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ
(таблицы, список сокращений, описание математической обработки)

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Головной мозг характеризуется интенсивным уровнем энергетического метаболизма и высокой чувствительностью к недостатку кислорода.
В настоящее время проблема кислородного голодания мозга остается актуальной для специалистов различных профилей клинической и экспериментальной медицины: неврологии, нейрохирургии, анестезиологии, реаниматологии, патологической физиологии, биохимии В отечественной и зарубежной литературе уже достаточно полно рассмотрены приспособительные реакции дыхательной, сердечно-сосудистой и кроветворной систем организма к условиям кислородной недостаточности Однако молекулярные механизмы развития острой ишемии во многом остаются малоизученными, хотя именно они дают представление о фундаментальных основах регуляции хода важнейших реакций, позволяющих поддерживать жизнеспособность клеток при снижении кровоснабжения мозга (Никитина И.А., 2002; Choi SH., 2005, Хватова Е.М.. 2005). Широко известно, что все функции головного мозга являются энергозависимыми В связи с этим решающее значение при нарушении мозгового кровообращения имеет состояние энергетического метаболизма (Хватова Е.М., 1992; Дудченко А.М., 2004). Одним из главных направлений его исследования является выяснение механизмов действия ишемии на интегральные системы энергетического обмена нервных клеток, оценка метаболизма мозга по характеристике ферментативных реакций и изучение свойств ключевых ферментов
Центральное место в процессах накопления, транспорта и регуляции баланса внутриклеточной энергии занимает креатинфосфокиназная система (Walzel В., 2002; Dzeja PP., 2003). В условиях энергодефицита, который имеет место при острой ишемии головного мозга особенно важное значение приобретает процесс образования и доставки энергетических эквивалентов к

местам их потребления Митохондриальная креатинкиназа, входящая в состав функционального комплекса межмембранного контактного сайта с транслоказой адениловых нуклеотидов и белком - порином наружной митохондриальной мембраны, катализирует образование
высокоэнергетического соединения - креатинфосфата и играет важнейшую роль в направленном транспорте энергии из митохондрий в цитоплазму клетки, а также в стабилизации уровня макроэргических соединений аденилового пула, то есть является одним из ключевых ферментов энергетического метаболизма (Wyss М., 1992; Askenasy N.. 2002; Schlattner U„ 2006).
В настоящее время актуально такое направление нейробиологии и медицины как профилактика повреждающего влияния гипоксии/ишемии без фармакологических вмешательств и раскрытие внутриклеточных механизмов повышения толерантности мозга к неблагоприятным воздействиям (Цветкова
А.М., 2005; Vlasov T.D., 2005). Ранее было показано, что интервальное гилоксическое лрекондиционирование приводит к изменениям в функционировании дыхательных ферментов, тем самым повышая устойчивость к гипоксии (Колчинская А.З., 1992; Лукьянова Л.Д., 2002, Миллер О.Л., 2003; Хватова Е.М., 2005). Тем не менее, молекулярные механизмы гипоксического прекондиционирования до сих пор во многом остаются непознанными (Рослый И М., 1999; Наградова Н.К., 2000; Ушаков И.Б., 2004), как и выбор оптимального тренировочного режима (Цветкова
А.М., 1999; Долова Ф.В., 2000; Маев Э.З., 2004; Куликов В.П.. 2005). Изучение свойств митохондриальной креатинкиназы мозга в условиях ишемии и интервального гипоксического прекондиционирования вносит вклад в фундаментальные представления о возможности регуляции энергетического гомеостаза мозга посредством креатин киназной системы в измененных условиях жизнедеятельности организма.

2. Методы исследования
2.1. Выделение митохондриальной фракции головного мозга
Для выделения митохондриальной фракции головного мозга применялся метод дифференциального центрифугирования (Бопю А., 1960: Диже Г.П.. 2003).
Животных декапитировали. головной мозг быстро извлекали и отмывали в растворе сахарозы (0,32 М; pH 7.4). Все работы проводились при температуре окружающей среды 0-6°С. Большие полушария мозга отделяли и тщательно очищали от оболочек Ткань измельчали в гомогенизаторе (стекло-тефлон) со скоростью 200 об./мин. в 10-ти кратном объеме среды выделения, содержавшей 0.32 М сахарозу. 10 мМ трис-НС1 и 1 мМ ЭДТА (pH 7.4). Полученный 10% гомогенат центрифугировали 10 минут на центрифуге ЦДР-1 при 1000g Надосадочную жидкость осторожно сливали и повторно центрифугировали 15 минут при 12500 g. Осадок промывали раствором сахарозы (0.32 М; pH 7.4). ресуспендировали и центрифугировали 15 минут при 16500 g. Полученный после центрифугирования осадок содержал фракцию митохондрий головного мозга.
2.2. Выделение субмитохондриальных фракций
Для выделения субмитохондриальных фракций наружную мембрану митохондрий разрушали гипотонической обработкой. Для этого осадок, полученный после дифференциального центрифугирования, разводили в ледяной (0-4° С) дистиллированной воде и вручную гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с притертым пестиком. Полученную суспензию разводили водой до конечной концентрации митохондриального белка в растворе около 1 мг/мл и инкубировали 30 минут. Полученная фракция митохондрий, подвергнутых гипотонической обработке (далее в тексте