Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов

• Автор: Пахомов, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Пространственная структура БРР-подобных белков
1.2. Влияние структуры хромофора на спектральные свойства
1.2.1. Хромофор вРР-типа
1.2.2. “Красный” хромофор Бзііесі-типа
1.2.3. Варианты расширения л-системы вЕР-хромофора, сопровождающиеся фрагментацией белка
1.2.4. Замена ароматического заместителя в хромофоре ОРР
1.3. Окружение хромофора: тюнинг цвета в ОРР-подобных белках
1.3.1. Стекинг-взаимодействия с хромофором
1.3.2. Ионизация хромофора
1.3.3. Конформационное состояние хромофора определяет безизлучательное
(хромо), либо флуоресцентное состояние белка
1.3.4. Влияние других аминокислотных остатков в окружении хромофора
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реактивы и материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Штаммы
2.1.3. Питательные среды для роста бактерий
2.1.4. Синтетические олигонуклеотиды
2.2. Биосинтез и выделение белка
2.2.1. Трансформация клеток Е.соїі плазмидной ДНК
2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток штамма ЛА109
2.2.1.2. Приготовление компетентных клеток шталтаХИ-В1ие
2.2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК

2.2.2. Экспрессия генов рекомбинантных белков
2.2.3. Выделение рекомбинантных белков
2.3. Мутагенез
2.3.1. Сайт-направленный мутагенез
2.3.2. Выделение плазмидной ДЫК
2.3.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
2.3.4. Количественные определения препаратов ДНК
2.3.5. Секвенирование ДНК
2.4. Денатурация и протеолиз белка
2.4.1. Денатурация в кислых условиях и протеолиз белка пепсином
2.4.2. Денатурация в щелочных условиях и протеолиз белка химотрипсином
2.5. Выделение хромопептидов
2.6. УФ-видимая спектрофотометрия и флуорометрия
2.7. ЭПР-спектрометрия
2.8. Масс-спектрометрия
2.9. Компьютерное моделирование пространственной структуры белка
2.10. Кинетический анализ созревания белка
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение структуры хромофора Z2FP574
3.1.1. Биосинтез и выделение белка Z2FP574
3.1.2. Денатурация и протеолиз белка Z2FP574
3.1.3. Выделение хромопептида
3.1.4. Масс-спектрометрические исследования хромопептида
3.1.5. Зависимость синтеза хромофора z2FP574 от света
3.2. Кинетические особенности созревания “красного” хромофора в Z2FP574
3.3. Сравнительный мутагенез белков Z2FP574 и ZFP506
3.3.1. Мутагенез, экспрессия генов мутантных форм белка, их выделение и очистка

3.3.2. Свойства мутантного белка zFP506 N66D
3.3.2.1. Изучение кинетических особенностей образования “красного ” хромофора
в zFP506 N66D
3.3.2.2. Исследование зелено-красного превращения zFP506 N66D при помощи масс-спектроскопии
3.3.2.3. Изучение механизма конверсии zFP506 N66D с помощью ЭПР
3.3.3. Влияние декарбоксилирования на окисление хромофора
3.3.3.1. Свойства мутантного белка z2FP574 D66A
3.3.3.2. Свойства мутантного белка z2FP574 D66N
3.3.3.3. Свойства мутантного белка z2FP574 D66E
3.4. Инициация Z2FP574 механизма в других белках. Влияние окисления на декарбоксилирование хромофора
3.4.1. Введение Asp в хромофор зеленых белков
3.4.2. Мутагенез cgCP
3.5. Механизм декарбоксилирования хромофора Z2FP574
3.6. Перспективы использования процесса сопряженного окисления-декарбоксилирования флуоресцентных белков в биотехнологии
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

осаждали 4M сульфатом аммония, центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин, супернатант затем удаляли. Осадок ресуспендировали в 200 мкл буфера ST (20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 8.0), содержащего 4M сульфата аммония, и затем переносили в кварцевую ампулу. Ампулу устанавливали в центрифужную пробирку на 15 мл, и центрифугировали при 2500 g. После этого супернатант удаляли, а образец хранили при 4°С до съёмки спектра.
2.8. Масс-спектрометрия
MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ хромопептидов проводили на масс-спектрометре Vision 2000 (Thermo Bio Analyses), работающем в линейном режиме, а также на Bruker Daltonics ultraflex MALDI TOF/TOF масс-спектрометре в режиме рефлектрона. Образец пептида в количестве ~10 пкМ наносили на матрицу, в качестве которой использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) либо а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (а-суапо). При использовании последней, пики хромопептидов, как правило, имели максимальную интентивность в масс-спектре.
ESI масс-спектрометрический анализ хромопептидов проводили на масс-спектрометре Thermo Finnigan LCQ deca XP, снабженным источником ионизации в электроспрее (ESI) и анализатором “ионная ловушка”. Пептид вводили в источник ионизации в количестве 5 пкМ в 0.1% муравьиной кислоте в водно-метанольном растворе 50/50 (объемное соотношение) со скоростью 3 мкл/мин. Рабочая температура капилляра составляла 210°С, газовая оболочка капилляра была установлена на значении 7 ед. и напряжение на игле - +3,2 кВ. В МС/МС экспериментах использовалась относительная энергия столкновения - 29-35% и ширина зоны захвата пика составляла 1,2 Да.