Природные антитела с оксидоредуктазными активностями

• Автор: Намжил Эрдэнэчимэг
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
АФК активные формы кислорода
ПОЛ перекисное окисление липидов
АИ аутоиммунный
ЛНП липопротеин низкой плотности
АТР аденозин-5'-трифосфат
ЫАОРН никотинамидадениндифосфонуклеотид, восстановленный
ИУК индолилуксусная кислота
гпо глутатионпероксидаза
гт глутатионтрансфераза
оэн окисленный глутатион
0880 восстановленный глутатион
МПО миелопероксидаза
ЭПО пероксидаза в эозинофилах
СОД супероксиддисмутаза
АТ антитела
мАТ моноклональные антитела
АГ антиген
ІЕ иммуноглобулины
ВИП вазоактивный интестинальный пептид
АИЗ аутоиммунные заболевания
САПС стабильный аналог переходного состояния
СКВ системная красная волчанка
РС рассеянный склероз
АИТ аутоиммунный тиреоидит
ПХ пероксидаза хрена
САЭМ спектрально атомно-эмиссионный метод
ОАВ 3,3’- диаминобензидин
ТХУ трихлоруксусная кислота
о-ФД орото-фенилендиамин
ОУА относительная удельная активность
;;ГХ /з-гидрохинон
БСА бычий сывороточный альбумин
ОА относительная активность
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Активные формы кислорода в организме
1.1.1. Пероксид водорода
1.1.2. Супероксидный анион - радикал
1.1.3. Синглетный кислород
1.1.4. Гидроксил радикал
1.1.5. Оксид азота
1.2. Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме
1.3. Антиокислительная защита организма
1.3.1. Механизмы внутриклеточной антиокислительной защиты
1.3.1.1. Супероксидцисмутаза
1.3.1.2. Каталаза
1.3.1.3. Ііероксидаза
1.3.1.4. Глутатион зависимые ферменты
1.3.2. Механизмы неферментативной природы
1.4. Иммуноглобулины
1.5. Каталитически активные антитела
1.5.1. Природные каталитически активные антитела при различных аутоиммунных патологиях
1.5.2. Возможные механизмы образования природных абзимов
1.5.3. Природные абзямы с протеазной активностью
1.5.4. Природные абзимы с нуклеазными активностями З
1.5.5. Природные абзимы с другими активностями
1.5.6. Абзимы с оксидоредуктазной активностью
1.6. Доказательство принадлежности каталитических активностей антителам
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Реактивы и материалы
2.2. Методы
2.2.1. Получение сыворотки крови
2.2.2. Выделение антител из плазмы крови крыс аффинной хроматографией

на Protein A-Sepharose
2.2.3. Очистка IgG с помощью гель-фильтрации
2.2.4. Электрофоретический анализ белков •
2.2.5. Концентрирование препаратов белка
2.2.6. Определение концентрации белка
2.2.7. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей антител
2.2.8. Иммунизация кроликов
2.2.9. Определение оптимального значения pH в реакции окисления 3,3'-диаминобензидина (DAB) антителами
2.2.10. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей
белков в полиакриламидном геле
2.2.11. Проведение pH-шока антител
2.2.12. Исследование влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител
2.2.13. Определение катадазной и глутатионпероксидазной активностей АТ
2.2.14. Определение кинетических параметров реакции окисления субстрата антителами
2.2.15. Анализ содержания металлов в препаратах антител
2.2.16. Хроматография АТ на сорбенте, хелатирующем ионы металлов
2.2.17. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей
методом флуоресценции
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение препаратов антител из сыворотки крови крыс линии Wistar
3.2. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в
препаратах антител
3.3. Определение оптимальных условий реакции окисления
3,3'-диаминобензидина антителами
3.3.1. Исследование зависимости пероксидазной активности от pH среды
3.3.2. Зависимость пероксидазной активности от концентрации
пероксида водорода
3.4. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам
3.4.1. Кислый шок препаратов антител
3.5. Локализация активных центров антител
3.5.1. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей
методом in situ

контрольных проб, не содержащих АТ, но максимальное изменение поглощения в контроле не превышало 5-20 % от такового в опыте.
2.2.13. Определение каталазной и глутатионпероксидазной активностей АТ
Каталазную активность IgG определяли, как описано в [155]. Разложение пероксида водорода оценивали по уменьшению поглощения при 1=240 нм (Є240 = 39.4 л моль''см'') во времени с помощью милихрома-1-A. Реакционная смесь (100 мкл) содержала 20 мМ калий-фосфатный буфер. pH 7.5, 10 мМ Н2О2, и АТ в концентрации 0.2 мг/мл. В некоторых экспериментах в реакционную смесь добавляли 0.5 мкМ CUSO4. Глутатионпероксидазную активность АТ определяли, как описано [156], по изменению поглощения при 1=340 нм (22°С) в течение 24 мин.
В качестве контролей использовали реакционные смеси, не содержащие АТ. За единицу активности принимали количество фермента (АТ), окисляющее 1 мкмоль субстрата DAB за 1 мин,
2.2.14. Определение кинетических параметров реакции окисления субстрата
антителами
Все измерения проводили на участках линейной зависимости скорости реакции от времени и концентрации субстрата (DAB, о-ФДА, NADH, фенол, а-нафтол). Величины Кн и УПт, были оценены с помощью метода нелинейной регрессии с использованием программ Microcal Origin v5.0, а также с помощью прямого линейного графика Эйзенталя и Корниш-Боудена и метода двойных обратных координат Лайнувера-Берка [157-159]. Ошибка определения величин не превышала 10 - 30%.
2.2.15. Анализ содержания металлов в препаратах антител
После адсорбции очищенных препаратов IgG антител на Protein A-Sepharose (см. п. 2.2.1) для элюции связанных с АТ ионов металлов колонку промывали 25 мл буфера (50 мМ Трис-НС1 ’, pH 7.5, 100 мМ ЭДТА) и элюат лиофилизовали. Лиофилизованные образцы препаратов АТ (5-7 мг) анализировали на содержание металлов с помощью атомно-эмиссионного метода с возбуждением спектров (САЭМ) в двухструйном дуговом плазмотроне согласно [160, 161] в НИОХ СО РАН. Контрольный препарат получали лиофилизацией 25 мл буфера, пропущенного через колонку без АТ.