Эритроцит как переносчик антрациклинового антибиотика Митоксантрона и антигемофильного препарата фактора IX системы свертывания крови "Aimafix D.I."

• Автор: Вуймо, Татьяна Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Использование различных типов переносчиков для адресной
доставки и создания пролонгировнных форм препаратов
1.1.1. Адъюванты
1.1.2. Моноклональные антитела
1.1.3. Макромолекулярные переносчики
1.1.4. Липосомы и другие микрокапсулы
1.1.5. Липосомалъная форма митоксаптрона
1.1.6. Изменение концентрации митоксаптрона в плазме после
введения липосомальпого или свободного митоксаптрона in vivo
1.1.7. Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов
1.1.8. Примеры использования эритроцитов в качестве переносчиков лекарственных репаратов
1.2. Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами
1.3. Сведения о лекарственных препаратах, использованных
в данной работе
1.3.1. Митоксантрон
1.3.2. Фактор IXсистемы свертывания крови
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Получение эритроцитов нагруженных митоксантроном
2.2.2. Приготовление лизатов эритроцитов
2.2.3. Приготовление хлороформных экстрактов проб
2.2.4. Измерение концентрации свободного гемоглобина
2.2.5. Измерение выхода митоксаптрона из загруженных эритроцитов
2.2.6. Измерение распределения эритроцитов по плотностям в суспензиях с различной концентрацией митоксаптрона
2.2.7. Биотшилирование препарата фактора IX
2.2.8. Определение степени биотинилирования фактора IX
2.2.9. Включение биотинилированного фактора IXв эритроциты

2.2.10. Изучение фармакокинетики биоттипированного препарата фактора IX
2.2.11. Измерение концентрации биотинилированного препарата фактора IX в плазме и внутри эритроцитов
Г ЛАВА 3. Результаты
3.1. Загрузка митоксантрона в эритроциты
3.2. Влияние температуры на кинетику загрузки эритроцитов митоксантроном
3.3. Влияние гематокрита суспензии на эффективность загрузки митоксантрона в эритроциты
3.4. Выход депонированного митоксантрона из эритроцитов
3.5. Влияние присутствия митоксантрона на сохранность эритроцитов
3.5.1. Влияние температуры инкубации и концентрации митоксантрона
па скорость гемолиза нагруженных эритроцитов
3.5.2. Влияние митоксантрона на распределение эритроцитов по плотностям
3.6. Включение биотинилированного фактора IX в эритроциты
3.7. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного
фактора IX, введенного внутривенно в виде раствора
3.8. Изучение фармакокинетики препарата биотинилированного
фактора IX, включенного в эритроциты
3.9. Расчет времени полувыведения фактора 1Хы<ц,
включенного в эритроциты
ГЛАВА 4. Обсуждение
4.1. Создание новой лекарственной формы антрациклинового
антибиотика митоксантрона на основе эритроцитов-носителей
4.2. Антигемофильный фактор IX, включенный в эритроциты
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
В современной фармакологии все более отчетливо проявляются две ведущие тенденции: 1- создание методов направленной («адресной») доставки фармакологических препаратов; 2 - разработка новых лекарственных форм для создания в организме человека депо фармакологических препаратов, обеспечивающих постепенное высвобождение препарата, получение пролонгированного эффекта, повышение терапевтической эффективности препарата, а также снижение его токсичности.
Определяющую роль в решении этих задач играют переносчики лекарственных средств. Они позволяют не только создать депонированную форму введенного соединения, но и защитить лекарство от преждевременного разрушения и инактивации ретикулоэндогелиалыюй системой организма; предотвратить или уменьшить иммунные и аллергические реакции организма на введенный препарат; осуществлять его направленный транспорт в органы и ткани-мишени.
Одной из важнейших предпосылок для успешного применения различных лекарственных препаратов, фармакологически или физиологически активных веществ (ФАВ) является специфичность их действия. Однако большая часть этих лекарственных соединений взаимодействует также и со значительным числом неспецифических мишеней. Это обстоятельство было наглядно продемонстрировано на примере химиотерапии онкологических заболеваний. Медленный прогресс в этой области является следствием неспособности практически всех цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки [2]. Низкая избирательность лекарственного препарата требует повышения дозы вводимого вещества, чтобы обеспечить его терапевтическую эффективность. Это приводит к усилению общего токсического действия препарата на организм и часто сопровождается развитием лекарственной устойчивости опухолевых или патологически измененных клеток к стандартным формам препарата. Включение лекарства в несущие микрокапсулы или аутологичные клетки-носители снижает пиковые концентрации свободного препарата в крови в момент введения, что понижает его токсическое действие, а также способствует снижению иммунного ответа организма на препарат, т.е. препятствует быстрому развитию устойчивости по отношению к введенному лекарству.
Переносчики лекарственных препаратов должны удовлетворять всем требованиям, которые предъявляются к любым веществам, вводимым в организм. Они должны быть нетоксичны, не иметь, или иметь минимальные побочные эффекты и быть способными к биодеградации - разложению и выведению продуктов переработки переносчика
образовывался ярко-желтый раствор комплекса, концентрация авидина в котором составляла 8 мкМ. Раствор хранили при +4°С не более 2 недель.
Раститровку стандартного раствора D-биотина в PBS (7.8 мкг/мл или 32 мкг/мл) и всех исследуемых образцов, содержащих биотин, производили в стандартном 96-луночном планшете. Измеряли концентрацию комплекса НАВА4-авидин спектрофотометрически на планшетном инструменте Microplate Reader Benchmark, Bio-Rad (Xmax=500 пт, Є5оопт=34000 Мст'1). Концентрацию биотина в образцах (в мкМ) определяли, пользуясь калибровочной кривой, построенной с использованием данных титрования биотина.
Степень биотинилирования (отношение количества молекул белка к количеству молекул связанного с ним биотина) рассчитывали как отношение молярных концентраций белка и биотина. Расчет проводили, пересчитывая весь белок на фактор IX. Молекулярный вес фактора принимали равным 55000 Da.
Степень биотинилирования белка в составе препарата фактора IX составила 1:4, т.е. на одну молекулу белка связывалось примерно 4 молекулы биотина.
3.2.9. Включение биотинтированного фактора IXв эритроциты
Включение препарата фактора IX в эритроциты проводили методом ступенчатого диализа [13, 9JJ в полностью стерильных условиях. Для выделения эритроцитов кровь, забранную из локтевой вены в раствор 3.8% цитрата натрия (соотношение кровь: цитрат=9:1) центрифугировали, эритроциты отмывали затем 3 раза стерильным физиологическим раствором. В предварительно замоченный на 4 часа в растворе PBS с добавлением 5 мМ глюкозы диализный мешок помещали 2 мл отмытой эритромассы (с гематокритом 88%) и 0.8 мл разбавленного в том же буфере раствора биотинилированного препарата фактора IX (5.8 мг/мл). Мешок помещали в стакан с мешалкой, содержащий 200 мл охлажденного до +4°С гипоосмотического буфера (pH 7.45), содержащего 12.5 мМ КН2РО4, 5 мМ MgCl2, 12.5 мМ глюкозы и 3.75 мМ аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Для доведения pH был использован раствор гидроксида калия. Диализ проводили при +4°С. После 20 мин диализа в стакан с буфером было добавлено 60 мл стерильной дистиллированной воды и диализ продолжали еще 20 мин. Процесс повторяли. На каждой ступени диализный мешок с эритроцитарной массой выдерживали при определенной концентрации внешнего буфера в течение 20 минут. Суммарно делали 5 добавлений дистиллированной воды, после чего объем диализующего буфера стал равным 500 мл, т.е. концентрации всех составляющих буфера уменьшились в 2.5 раза.