Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина

• Автор: Михайлова, Валерия Вадимовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. О-актин
2. Полимеризация О-актина
3. Р-актин
4. Взаимодействие актина с другими белками
4.1 Кофилин
5. Тепловая денатурация актина
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
1. Препаративные методы
1.1. Получение ацетонового порошка для выделения актина
из скелетных мышц кролика
1.2. Выделение актина из ацетонового порошка
1.3. Определение концентрации белка
1.4. Получение Р-актина и его стабилизация
2. Используемые методы исследования
2.1. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
2.2. Исследование агрегации Р-актина методом светорассеяния
2.3. Аналитическое соосаждение
2.4. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии БОБ
2.5. Метод флуоресцентной спектроскопии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Исследование тепловой денатурации актииовых филаментов
1.1. Влияние состава буфера на процесс тепловой денатурации
Р-актина
1.2. Влияние нуклеотидов на характер тепловой денатурации актиновых филаментов.
1.3. Зависимость тепловой денатурации F-актина от концентрации белка.
1.4. Предполагаемый механизм тепловой денатурации актинового филамента.
1.5. Данные литературы, свидетельствующие в пользу «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.
1.6. Тепловая агрегация актина.
1.7. Исследование процесса тепловой денатурации актина при помощи гидрофобного флуоресцентного зонда ANS.
1.8. Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации.
Глава 2. Влияние кофилина на тепловую денатурацию актина.
2.1. Эффекты кофилина в насыщающих концентрациях.
2.2. Эффекты кофилина в концентрациях ниже насыщающих. Кооперативная дестабилизация F-актина.
2.3. Влияние стабилизаторов F-актина на тепловую денатурацию его комплексов с кофилином.
2.4. Два противоположных эффекта кофилина на тепловую денатурацию F-актина: обсуждение результатов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Стабилизация и дестабилизация F-актина кофилином в свете
«диссоциативного» механизма тепловой денатурации
актиновых филаментов.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ аденозиндифосфат
АТФ аденозинтрифосфат
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия
ПААТ полиакриламидный гель
Трис трис-(гидроксиметил)-метиламин
ADF/кофилин семейство белков, деполимеризующих актин (Actin
Depolymerizing Factor)
ANP А-(4-азидо-2-нитрофенил) путресцин
ANS 1-анилино-8-нафталин-1-сульфоновая кислота
ß-ME ß-меркаптоэтанол
ЕСР32 бактериальная протеаза, выделенная из E. Coli и
специфически расщепляющая актин между остатками Gly42 и Val43 в ДНКаза I-связывающей петле F-актин фибриллярный актин
G-актин глобулярный актин
Hepes К-(2-гидроксиэтил) пиперазин-К!,-(2-этаносульфоновая
кислота)
FIsp27 малый белок теплового шока человека с кажущейся
молекулярной массой 27 кДа Hsp27-wt малый белок теплового шока человека с кажущейся
молекулярной массой 27 кДа дикого типа Hsp27-3D малый белок теплового шока человека с кажущейся
молекулярной массой 27 кДа с заменой Sert5, Ser7S,
Ser82 на остатки Asp.
FIsp24-wt малый белок теплового шока птиц с кажущейся
молекулярной массой 24 кДа дикого типа SDS додецилсульфат натрия
sHSP малые белки теплового шока (small heat shock proteins)

находятся в набухшем состоянии), добавляли к нему дистиллированную воду (из расчета 1200 мл воды на 100 г осадка) и сразу отжимали через 4 слоя марли. К осадку добавляли пять объемов 0,4 % NaHC03 при комнатной температуре и выдерживали 30 минут при перемешивании. Жидкость отжимали через марлю, а осадок смешивали с 2 объемами раствора, содержащего 0,01 М NaHC03 и 0,01 М Na2C03 при 10°С. Раствор перемешивали 10 минут, а затем разводили в 10 раз дистиллированной водой при комнатной температуре и снова фильтровали через 4 слоя марли, тщательно отжимая. Осадок имеет вид набухших частичек желатина. Оставшийся на марле осадок несколько раз промывали холодным ацетоном и отжимали до тех пор, пока фильтрат не переставал пениться и опалесцировать. Последние промывки проводили на воронке Бюхнера. Полученный осадок высушивали на фильтровальной бумаге в течение 2-3 дней при комнатной температуре и хранили при той же температуре более года.
1.2. Выделение актина из ацетонового порошка [Spudich, Watt, 1971].
К навеске ацетонового порошка (1 г) добавляли 20 мл буфера G (2 мМ трис-НС1, pH 8,0, 0,2 мМ АТФ, 0,2 мМ СаС12, 0,5 мМ ß-меркаптоэтанол) и оставляли на льду в течение 45 минут при постоянном перемешивании. Нерастворенные остатки тканей удаляли центрифугированием в течение получаса при 20 000 оборотов в минуту на роторе Ti-60. Актин, содержащийся в супернатанте, полимеризовали добавлением КС1 и MgCl2 до конечных концентраций 50 мМ и 2 мМ, соответственно. Указанные растворы добавляли постепенно, постоянно перемешивая раствор. После 2 часов инкубации на холоде добавляли КС1 до конечной концентрации 0,6 М (до 0,55 М, учитывая, что в пробе уже содержится 0,05 М КС1). Цилиндр с раствором белка оставляли на ночь на холоду. Полимеризованный актин собирали центрифугированием в роторе Ti-75 при 105000 g в течение 3 часов. Осадок ресуспендировали в нескольких миллилитрах буфера G и измельчали в гомогенизаторе Поттера. Полученный раствор диализовали против буфера G в течение трех дней с ежедневной сменой диализа для постепенной деполимеризации актина. Последний диализ проводили против буфера G, содержащего 0,1 мМ NaN3. Остатки полимеризованного F-актина удаляли центрифугированием в роторе Ti-75 при* 140000 g в течение трех часов.