Супрамолекулярные комплексы нуклеиновых кислот как эффективные системы трансфекции клеток

• Автор: Гусаченко, Олеся Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 166 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: МОДИФИЦИРОВАННЫЕ
СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИХ ПРОНИКНОВЕНИЯ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ Л1
1.1. Введение: препараты на основе нуклеиновых кислот (НК)
1.2. Влияние структуры НК на эффективность их проникновения в эукариотические клетки
1.2.1. Механизмы естественного транспорта НК в эукариотические клетки
1.2.1.1. Исследования механизмов проникновения НК в клетки in vitro
1.2.1.2. Исследования проникновения НК в клетки in vivo
1.1.2. Влияние химических модификаций па взаимодействие олигонуклеотидов с эукариотическими клетками
1.1.2.1. Модифицир о ванные аналоги олигонуклеотидов
1.1.2.2. Влияние введения липофилъных групп на захват олигонуклеотидов клетками
1.1.2.3. Введение адресующих молекул в состав олигонуклеотидов
1.1.3. Влияние образования супрамолекулярных структур НК на взашюдействие с клетками
1.1.3.1. Трансфекция в двуцепочечной форме
1.1.3.2. Агрегация олигонуклеотидов с G-богатыми последовательностями
1.1.3.2. РНК-наночастицы
1.2. Конденсация НК и образование комплексов с попиэтипиниминами как эффективный метод трансфекции
1.2.2. Влияние структуры PEI и условий образования комплексов с НК на эффективность трансфекции НК
1.2.3. Модификации PEI
1.2.3.1. Гидрофильные полимеры
1.2.3.2. Биодеградируемые сополгшеры
1.2.3.3. Гидрофобные и амфифильные полимеры
1.2.3.4. Присоединение тканеспецифических лигандов
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и препараты

2.1.2. Оборудование
2.1.3. Клеточные линии
2.1.4. Олигонуклеотиды
2.1.5. Растворы и буферы, использованные в работе
2.2. Методы
2.2.1. Гель-электрофорез
2.2.1.1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.1.2. Нативный электрофорез в ПААГ
2.2.1.3. Электрофорез в агарозном геле
2.2.2. Синтез холестериновых производных олигонуклеотидов
2.2.3. Введение [32Р]-содержащей фосфатной группы по 5 ’-концу олигонуклеотида
2.2.4. Введение остатка флуоресцеина по 5 ’-концу олигонуклеотида
2.2.5. Получение конкатемерных комплексов
2.2.6. Приготовление дуплексов в1РНК
2.2.7. Определение температур плавления конкатемерных комплексов
2.2.8. Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ)
2.2.9. МТТ-тест
2.2.10. Трансфекция НК в клетки
2.2.10.1. Трансфекция с помощью РЕЮ и коммерчески доступных трансфектантов
2.2.10.2. Трансфекция олигонуклеотидов в свободной форме и в форме
супрамолекулярных комплексов
2.2.11. Измерение эффективности связывания олигонуклеотидов с клетками
2.2.12. Микроскопический анализ
2.2.13. Определение уровня экспрессии ЕСЕР в клетках
2.2.13.1. Спектрофлуориметрическое измерение флуоресценции клеток
2.2.13.2. Измерение суммарной концентрации белка
2.2.14. Проточная цитофлуориметрия
2.2.15. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.16. Измерение уровня экспрессии определенных генов в культивируемых клетках методом ОТ-ПЦР
2.2.16.1. Получение кДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ: СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫЕ
КОМПЛЕКСЫ НК КАК ЭФФЕКТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ
3.1. Предобразование супрамолекулярных комплексов НК как способ трансфекции
3.1.1. Образование олигонуклеотидами конкатемерных комплексов в растворе
3.1.1.2. Влияние состава буферного раствора и условий инкубации па образование конкатемерных комплексов
3.1.1.3. Влияние состава смеси олигонуклеотидов на размер образующихся комплексов
3.1.2. Определение эффективности связывания конкатемерных комплексов олигонуклеотидов с опухолевыми клетками
3.1.2.1. Описание используемых клеточных линий
3.1.2.2. Уровень связывания конкатемерных комплексов и одноцепочечных олигонуклеотидов с клетками различных линий
3.1.2.3. Кинетическая и концентрационная зависимости связывания с клетками конкатемерных комплексов олигонуклеотидов
3.1.2.4. Влияние длины конкатемеров на эффективность связывания с клетками
3.1.3. Получение холестерин-модифицированных конкатемерных комплексов и их взаимодействие с эукариотическими клетками
3.1.3.1. Эффективность образования конкатемеров холестерин-модифицированнъти аналогами олигонуклеотидов
3.1.3.2. Определение цитотоксичности конкатемеров и влияния обработки клеток копкатемерами па индукцию генов-маркеров интерферонового ответа
3.1.3.3. Эффективность проникновения олигонуклеотидов в клетки в составе холестерин-модифицированных конкатемеров
3.1.3.4. Внутриклеточная локализация олигонуклеотидов, доставляемых в клетки в составе холестерин-модифицированных конкатемеров
3.1.3.5. Подавление экспрессии гена-мишени с помощью антисмыслового олигонуклеотида, доставляемого в клетки в составе холестерин-модифицированного конкатемерного комплекса
3.1.4. Заключение
3.2. Эффективность трансфекции НК в комплексах с конъюгатами полиэтиленимина с холестерином
3.2.1. Влияние модификации холестерином на свойства конъюгатов РЕЮ
активного олигонуклеотида из циркуляции [128]. Группой под руководством Van Berkel была исследована фармакокинетика фосфоротиоатного олигонуклеотида, имеющего в своем составе два остатка холестерина, присоединенные по 3’- и по 5’-концам [129]. Согласно полученным результатам основная часть модифицированного олигонуклеотида после внутривенной инъекции крысам поглощалась органами ретикуолэндотелиальной системы, через 90 мин после инъекции преобладающая часть олигонуклеотидов (более 80% дозы) была обнаружена в клетках печени. Авторами данного исследования было предложено использовать модифицированные олигонуклеотиды, несущие холестерин на обоих концах молекулы, для направленного воздействия на молекулярные мишени, специфичные именно для клеток печени.
Зависимость биологической активности фосфоротиоатных антисмысловых олигонуклеотидов от количества модификаций холестерином (по обоим или по одному концу молекулы), а также от положения модификации (по 3’- или по 5’-концу) было исследовано на модели дифференцированных клеток РС12 [130]. Олигонуклеотид, содержащий холестерин на 5’-конце, был более эффективен, чем фосфоротиоатный олигонуклеотид без холестерина, но в целом проявлял достаточно низкую активность в отношении подавления экспрессии гена-мишени. Присоединение холестерина на 3’-конец приводило к повышению эффективности селективного ингибирования экспрессии гена мишени, а наибольший уровень подавления экспрессии наблюдался для конъюгата, содержащего холестерин на обоих концах олигонуклеотида. Возможно, в данном случае повышение активности антисмыслового олигонуклеотида было связано не только с большим уровнем его интернализации клетками, но и с большей устойчивостью конъюгата к действию экзонуклеаз.
Проникновение в клетки холестерин-модифицированных олигонуклеотидов, вероятно, обусловлено несколькими молекулярными механизмами. Неспецифическое связывание липопротеинами низкой плотности (LDL), присутствующими в биологических жидкостях, может обеспечить доставку холестерин-олигонуклеотидов в клетки благодаря связыванию с рецепторами липопротеинов, а также интернализции образуемых комплексов пиноцитозом. Несвязанные липопротеинами холестерин-олигонуклеотиды могут проникать в клетку благодаря взаимодействию молекулы холестерина с гидрофобной частью клеточной мембраны и последующему захвату по пути пиноцитоза. В работе [129] было сделано предположение о возможности связывания бис-холестерин-фосфоротиоатных олигонуклеотидов scavenger рецепторами клеток ретнкулоэндотелиапьной системы. Среди других возможных механизмов, вносящих вклад в повышение эффективности интернализации клетками и биологической активности