Фотореакционноспособные производные ДНК как инструмент для исследования эксцизионной репарации нуклеотидов

• Автор: Мальцева, Екатерина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. ДЕФЕКТЫ СИСТЕМЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ И НАСЛЕДСТВЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФАКТОРОВ РЕПАРАЦИИ
1.1.1. Заболевания человека, вызванные дефектами системы эксцизионной репарации нуклеотидов
1.1.2. Идентификация генов и белков, участвующих в NER
1.2. ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
1.2.1. Модели сборки репарационного комплекса в репарации целого генома
1.2.2. Репарация, связанная с транскрипцией
1.3. УЗНАВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
1.3.1. Модели узнавания повреждения: “ХРС первый”, ”ХРА первый” или ”RPA первый”
1.3.2. Модель двухкомпонентного узнавания повреждений ДНК
1.4. ФАКТОРЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
1.4.1. Комплекс XPC-hHR23B — потенциальный сенсор неспаренных оснований
1.4.2. Функции UV-DDB в эксцизионной репарации нуклеотидов
1.4.2.1. Роль UV-DDB в узнавании повреэ/сдений
1.4.2.2. Участие UV-DDB в реорганизации хроматина
1.4.2.3. UV-DDB и убиквитинилирование
1.4.3. Роль ХРА и RPA в NER
1.4.4. TFIIH: раскрытие ДНК вокруг повреждения
1.4.5. XPG и ERCC1-XPF: двойное разрезание поврежденной цепи эндонуклеазами
1.4.6. Застройка одноцепочечной бреши (ресинтез ДНК)
1.4.7. Дополнительные функции белков эксцизионной репарации нуклеотидов
1.4.1.7.1. Роль TF11H в транскрипции
1.4.7.2. Участие белков NER в эпигенетическом контроле
1.4.7.3. Стимулирование системы ВЕК: участие в спонтанном мутагенезе
1.4.7.4. Участие ХР-генов в контроле клеточного цикла и апоптозе
1.4.7.5. Роль ERCC1-XPF в других путях репарации
1.5. РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССА ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
С ПОМОЩЬЮ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЙ МОДИФИКАЦИИ
Заключение
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного ХРА человека, экспрессированного в клетках E
2.2.2. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков в ПААГ
2.2.3. Введение { Р)-метки по 5'-концу олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов
2.2.4. Формирование ДНК-дуплексов
2.2.5. Удлинение ДНК-праймера, катализируемое Pol ß (введение модифицированных dNTP в 3 ’-конец праймера)
2.2.6. Лигирование одноцепочечного разрыва (ника), катализируемое ДНК-лигазой фага Т4 (получение олигонуклеотидов с модифицированным dNMP в середине цепи)
2.2.7. Комтексообразование белков с ДНК (метод задержки в геле)

2.2.8. Фотоаффинная модификация белков
2.2.9. Конструирование двухцепочечной плазмиды, содержащей модифицированные dNMP
2.2.10. Вырезание повреждения системой NER
2.2.11. Идентификация продуктов модификации XPC-hHR23B помощью шшунобпоттинга
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
РАЗДЕЛ 3.1. ФОТОАКТИВНЫЕ НУКЛЕОТИДЫ ИМИТИРУЮТ ПОВРЕЖДЕНИЯ, ВЫЩЕПЛЯЕМЫЕ СИСТЕМОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ
3.1.1. Конструирование олигонуклеотидов, содержащих фотоактивируемую группу в середине цепи
3.1.2. Конструирование двухцепочечных кол1щевых ДНК, содержащих фотоактивируемую группу
3.1.3. Выщепление повреждения из двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивиую группу, в клеточном экстракте НеЬа
РАЗДЕЛ 3.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ XPC-HR23B С МОДЕЛЬНЫМИ ДНК-СТРУКТУРАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕОТИДОВ
3.2.1. Взаимодействие XPC-11R23B с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреждения фотореакционноспособные производные нуклеотидов -FAP-dCMP и FAP-dUMP
3.2.2. Взаимодействие XPC-HR23B с модельными ДНК-структурами, содержащими фотореакщюнноспособные остатки в поврежденной и неповрежденной цепи
РАЗДЕЛ 3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ХРА И RPA С МОДЕЛЬНЫМИ ДНК-СТРУКТУРАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕОТИДОВ
3.3.1. Взаимодействие RPА и ХРА с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреждения фотореакционноспособные производные нуклеотидов - FAP-dCMP и FAP-dUMP
3.3.2. Взаимодействие ХРА и RPA с модельными ДНК-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов в поврежденной и неповрежденной цепи
3.3.3. Взаимодействие RPA и ХРА с модельными фотоактивными ДНК-структурами, содержащими модифицированный dNMP на 3’- и 5 ’-конце одноцепочечного разрыва
РАЗДЕЛ 3.4. ВЛИЯНИЕ RPA И ХРА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ XPC-HR23B С МОДЕЛЬНЫМИ ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ДНК-СТРУКТУРАМИ
3.4.1. Влияние RPA и ХРА на модификацию XPC-HR23В с фотоактивируемыми ДНК-структурами, содерэюащими FAP-dCMP
3.4.2. Влияние RPA и ХРА на эффективность комплексообразования XPC-hHR23B с ДНК
Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
а.о. - аминокислотный остаток
е.а. - единиц активности
мРНК - матричная РНК
н.о. - нуклеотидный остаток
ПААГ - полиакриламидный гель
п.н. - пар нуклеотидов
РСА - рептгеноструктурный анализ
тРНК - транспортная РНК
УФ-свет — ультрафиолетовый свет
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
AAF-dGMP - 8-(1У-ацетил-аминофлюорен)-2'-дезоксигуанозин-5’-монофосфат
АпЙіг-с1СТР-з/сзо-М-(4-(9-антраценилгидразинкарбонил)-бутил-карбамоші)-2’-
дезоксицитидин-5 ’ -трифосфат
BER - эксцизионная репарация оснований
BSA - бычий сывороточный альбумин
CEN2 - центрин
CPD - циклобутанпиримидиновый димер CS - синдром Коккейна
CSA -фактор синдрома Коккейна комплементационной группы А CSB -фактор синдрома Коккейна комплементационной группы В dNTP - дезоксирибонуклеотид трифосфат DSB - двухцепочечные разрывы DTT - дитиотрейтол EtBr - бромистый этидий
FAB-dUMP — 5-{(4-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоиламшю)бутнл)-аминокарбонил-карбамоил-пропил-оксиметил}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат FAP-dCTP -экзо-М-{2-(Н-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпнридин-6-ил)-3-аминопропионил)аминоэтил}-2|-дезоксицитидин-5'-трифосфат
FAP-dUMP - 5-{Ы-(Ы-(4-азидо-2,5-дифтор-3-пиридин-б-ил)-3-аминопропионил)-транс-3-
аминопропенил-1} -2'-дезоксиуридші-5'-монофосфат
HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
ERCC - ген группы перекрестной комплементации
hHR23A - человеческий гомолог А белка Rad23 S. cerevisiae
hI IR23B - человеческий гомолог В белка Rad23 S. cerevisiae
GG-NER - эксцизионная репарация нуклеотидов целого генома
ICL - межцепочечные сшивки
IPTG - изопропил-Р-О-тиогалактозид

RPA 198 291305 402440510 616ao
p70 і

ДНК ДНК ДНК RPA32, і Zn-цинковый "палец" RPA14
1 63 10 27

5 121ао

р14 1,1 SBD
SBD-домен связывания с одноцепочечной ДНК А, В, С, D-ДНК-связывающие домены
Рис. 3. Доменная структура RPA (de Laat W.L. et al. 1999).
Оба белка, ХРА и RPA, имеют повышенное сродство к ДНК, содержащим нарушения двойной спирали, таким как неканонические пары, “пузыри” и небольшие петли (Missura М. et al. 2001). Предполагается, что RPA участвует в процессе NER совместно с ХРА. Действительно, показано, что RPA стабилизирует связывание ХРА с ДНК (Не Z. et al. 1995; Wang М., Mahrenholz A., Lee S.H. 2000). Тем не менее, по сравнению с ХРС-hHR23B, сродство комплекса XPA-RPA к поврежденной ДНК на порядок ниже (Неу Т., Lipps G., Krauss G. 2001; Lao Y., Lee C.G., Wold M.S. 1999). Предполагается, что эти белки могут участвовать во вторичной проверке наличия повреждения (Volker М. et al. 2001; Sugasawa K. et al. 1998; Evans E. et al. 1997).
Показано, что ХРА имеет строгое предпочтение к искусственно созданным ДНК-структурам, содержащим перекрещивающиеся ДНК-дуплексы (Missura М. et al. 2001; Camenisch U. et al. 2006). Кроме того, было обнаружено, что для узнавания повреждения необходимы два консервативных аминокислотных остатка, Lysl41 и Lysl79, и что изгибы ДНК в месте повреждения создают электростатический потенциал, который вносит свой вклад в узнавание поврежденной ДНК (Camenisch U. et al. 2007). Имеются также данные о том, что ХРА контактирует с обеими цепями ДНК и ингибирует ДНК-расплетающую активность RPA (Patrick S.M. and Turchi J.J. 2002). Поэтому предполагается, что ХРА может распознавать и стабилизировать изгибы ДНК, возникающие в процессе репарации. RPA, в свою очередь, детектирует и стабилизирует ДНК-интермедиаты, содержащие одноцепочечные участки. Открытый ДНК-дуплекс, образующийся после расплетания ДНК вокруг повреждения, несет в себе оба структурных элемента (изгибы ДНК и одноцепочечные участки) и поэтому может эффективно распознаваться комплексом RPA-