Трансгенез PVYntn-CP геном белка оболочки Y вируса картофеля для создания вирусоустойчивых растений

• Автор: Сташевски, Зенон
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 153 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Вирусы растений. Y-вирус картофеля
1.1.1. Систематическое положен ие YBK
1.1.2. Штаммы YBK
1.1.3. Строение YBK
1.1.4. Геном YBK
1.1.5. Белки YBK
1.1.6. Размножение YBK
1.1.7. Передвижение YBK по инфицированному растению
-.1.1.8. Взаимодействие между вирусами
1.2. Вирусные болезни растений табака N. tabacum L. и картофеля
S. tuberosum L
1.2.1. Заражение растений
1.2.2. Симптомы и патогенез
1.3. Устойчивость растений к вирусам
1.3.1. Вертикальная устойчивость растений к вирусам
1.3.2. Наследование вертикальной устойчивости к вирусам
1.3.3. Механизмы проявления вертикальной устойчивости растений к
вирусам
1.3.4. Горизонтальная устойчивость растений к вирусам
1.3.5. Механизмы проявления горизонтальной устойчивости растений к
вирусам
1.4. Создание трансгенных растений, устойчивых к вирусным болезням
1.4.1. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном
белка оболочки вируса
1.4.2. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном транспортного белка вируса
1.4.3. Вирусоустойчивость трансгенных растений, опосредованная геном вирусной репликазы
1.4.4. Механизм проявления патоген-опосредованной вирусоусгойчивости
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Вирусные штаммы и вектор для генетической трансформации
2.2. Растительный материал
2.2.1. Растения картофеля Solanum tuberosum L
2.2.2. Растения табака Nicotiana tabacum L

2.3. Питательные среды
2.4 Трансформация и регенерация растений
2.4.1. Трансформация и регенерация растений картофеля
2.4.2. Трансформация и регенерация растений табака
2.5. Молекулярные методы
2.5.1. ПЦР анализ и Саузерн-блоттинг анализ
2.5.2. Нозерн-блотгинг анализ
2.5.3. Дот-блот анализ
2.6. Иммунологические методы
2.6.1. Иммуноблотинг (вестерн-блоттинг анализ)
2.6.2. Иммуноферментный анализ
2.7. Фитопатологические методы исследования
2.7.1. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений методом механической инокуляции
2.7.2. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля методом прививки
2.7.3. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений в полевых условиях
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры
3.2. Подбор оксидантов для трансформации
3.3. Трансформация и регенерация растений
3.3.1. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L
3.3.2. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L
3.4. Анализ интеграции PVlAm-CP гена в геном растений табака
N. tabacum L. и картофеля S. tuberosum L
3.5. Изучение экспрессии PVYW7!s-CP гена
3.5.1 Нозерн-блоттинг анализ экспрессии PVY ' -СР гена в трансгенных растениях табака и картофеля
3.5.2 Вестерн-блоттинг анализ экспрессии PVY-CP гена в трансгенных растениях табака
3.5.3. Вестерн-блоттинг анализ экспрессии PVY™-CP гена в трансгенных растениях картофеля
3.5.4. Изучение стабильности экспрессии PVYsn-CP гена в трансгеиных растениях табака и картофеля
3.6. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений табака
N. tabacum L
3.6.1. Определение вирусоустойчивости с помощью механической
инокуляции в тепличных условиях
3.6.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях

3.7. Определение вирусоустойчивости трансгенных растений картофеля
S. tuberosum L
3.7.1. Определение впрусоустойчивости с помощью механической инокуляции в тепличных условиях
3.7.2. Определение вирусоустойчивости в полевых условиях
3.7.3. Определение впрусоустойчивости с помощью прививки на инфицированные YBKрастения
3.8. Изучение химического состава клубней и хозяйственно-ценных свойств трансгенных растений картофеля
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Получение микроклубней картофеля в условиях асептической культуры
4.2. Трансформация и регенерация растений картофеля S. tuberosum L
4.3. Трансформация и регенерация растений табака N. tabacum L
4.4. Экспрессия PVYwm-CP гена в трансгенных растениях табака и картофеля
4.5. Вирусоустойчивость трансгенных растений табака и картофеля
4.5.1. Фенотипическое проявление патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений
4.5.2. Зависимость степени патоген-опосредованной вирусоустойчивости от уровня экспрессии СР в трансгенных растениях табака и картофеля
4.5.3. Штаммоспецифичность вирусоустойчивости трансгенных растений, опосредованной PVY4™-СР геном YBKWU
4.5.4. Механизм патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений
4.5.5. Патоген-опосредованпое подавление супрессии РНК-интерференции в вирусоустойчивых трансгенных растениях
4.6. Практическое значение патоген-опосредованной вирусоустойчивости трансгенных растений
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
процесс в любой форме [УаИсопеп, 1994; Иванюк с соавт., 2005]. Крайняя устойчивость к вирусам выражается в сильном ограничении размножения вирусов или локализации вирусной инфекции в виде отдельных точечных некрозов (таблица 3). По мнению Росс [Росс, 1989] крайняя устойчивость -это усиленная локализованная сверхчувствительность, и тот и другой тип можно определить прививкой на пораженный вирусом подвой. На имунных к вирусу образцах симптомы вообще не появляются. При крайней устойчивости симптомы не появляются или на верхних листьях развивается точечный некроз, а на более старых побегах — краевой некроз нижних листьев. Рост главного стебля часто прекращается, но из боковых почек появляются бессимптомные побеги [Росс, 1989]. Биологические, серологические, ИФА и ПЦР тесты дают негативные результаты для обоих типов устойчивости за очень небольшими исключениями, которые могут быть обусловлены короткой начальной фазой размножения вируса или пассивным передвижением вирусных частиц по стеблю [БеШеу, 1974; БеШеу, 1975; Росс, 1989; УаИсопеп, 1994].
Сверхчувствительность является некротическим типом устойчивости (таблица 3). Проявление сверхчувствительности в растениях приводит к локализации распространения вирусной инфекции и выражается в виде некрозов в местах проникновения вирусных частиц. По степени развития некрозов можно выделить локализованную и системную сверхчувствительность. Растения, обладающие локализованной сверхчувствительностью, при прививке на пораженные вирусом привои показывают некротизацию верхушки побега. По степени защиты от вирусной инфекции локализованная сверхчувствительность занимает промежуточное место между крайней устойчивостью и системной сверхчувствительностью. Экспрессивность А-генов, обуславливающих реакцию
сверхчувствительности растений, как правило, умеренна. Несмотря на это, данный тип устойчивости, также как и два других выше описанных типа, обуславливает хорошую защиту от вируса, при которой на растениях в поле