Роль гипохлорита в регуляции апоптоза и фагоцитоза миелоидных клеток in vitro

• Автор: Ковалева, Анастасия Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Оглавление
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Роль миелопероксидазиой системы в воспалении
2.1.1. Миелопероксидазная система
2.1.2. Взаимодействие НОС1 с биомолекулами
2.2. Типы клеточной смерти
2.2.1. Апоптоз клеток в условиях хлорирующего стресса
2.2.1.1. Гибель клеток под действием хлораминов
2.2.2. Роль глутатиона в апоптозе
2.3. Роль фагоцитоза в воспалении
2.3.1. Фагоцитоз апоптотических клеток
2.3.2. Сигналы для фагоцитоза
2.3.2.1. Разнообразие рецепторов для распознавания апоптотических клеток
2.3.2.2. Роль фосфатидилсерина в фагоцитозе апоптотических клеток
2.3.2.3. Окисленные эпитопы, распознаваемые макрофагами
2.3.2.4. Фагоцитарный синапс
2.3.3. Иммунологические последствия фагоцитоза апоптотических и
некротических клеток
2.3.4. Фагоцитоз клеток в условиях хлорирующего стресса
3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Реагенты и оборудование
4.2. Культивирование клеток
4.3. Определение содержания апоптотических и некротических клеток в образце с помощью окрашивания АппехшУ/Р1
4.4. Определение концентрации глутатиона
4.5. Определение общей концентрации белковых БН - групп
4.6. Определение общей концентрации белка в клетках
4.7. Определение активности каспазы
4.8. Определение апоптотических клеток но морфологии ядер

4.9. Клеточные модели, использованные в работе
4.9.1 Подбор условий окрашивания клеток-мишеней
4.9.2. Модель токсичного воздействия хлорирующего стресса на клетки в PBS
(индукция некроза клеток под действием хлорирующего стресса)
4.9.3. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на клетки в среде
4.9.4. Токсичное воздействие хлорирующего стресса на клетки в среде (индукция аноптоза клеток под действием хлорирующего стресса)
4.9.5. Инкубация апоптотических HL-60 клеток с окислителями
4.10. Анализ фагоцитарной активности макрофагов
4.11. Приготовление липосом
4.12. Ингибирование фагоцитоза с помощью липосом
5. РЕЗУЛЬТАТЫ
5.1 Разработка метода оценки фагоцитарной активности макрофагов
5.1.1. Подбор условий для окрашивания клеток-мишеней
5.1.2. Подбор условий окрашивания макрофагов
5.1.3. Количественный анализ фагоцитарной активности макрофагов
5.1.4. Анализ полного и неполного фагоцитоза
5.2. Субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на выживаемость и фагоцитоз нативных лимфоцитов in vitro
5.3. Влияние токсичного воздействия хлорирующего стресса на фагоцитоз нативных клеток. Роль фосфатидилссрина
5.4. Изучение влияния хлорирующего стресса на апоптоз и фагоцитоз апоптотических клеток
5.4.1. Влияние хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток
5.4.2. Хлорирующий стресс индуцируют образование разрывов в плазматической мембране апоптотических клеток

5.4.3. Влияние хлорирующего стресса на экстернализацию фосфатидилсерина на поверхности апоптотических клеток
5.4.4. Ингибирование каспазы-3 в апоптотических клетках
5.4.5. Влияние хлорирующего стресса на уровень глутатиона и белковых SH-групп в нативных и апоптотических клетках
5.4.6. Фосфатидилсерин и окисленный гипохлоритом фосфатидилсерин ингибируют фагоцитоз апоптотических клеток
5.5. Влияние кислородного и нитрозитивного стрессов на фагоцитоз нативных и апоптотических клеток
6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6.1. Разработка метода анализа фагоцитарной активности макрофагов
6.2. Влияние гипохлорита на фагоцитоз нативных клеток
6.3. Роль гипохлорита в фагоцитозе апоптотических клеток
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
8. ВЫВОДЫ
9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

HEPES
Феноловый Красный натриевая соль
Пируват Натрия
Красители для клеток:
Пропидий йодид (PI), 4,4-дифлуоро-1,3,5,7-тетраметил-8-(4-малеймидилфенил)-4-бора-За-4а-диаза-з-индацен (BODIPY-малеимид, ВМ), 5-хлорометилфлуорссцеин диацетат (CellTracker™ Green, CMFDA), CellTrace Far Red DDAO-SE (CTFR), AnnexinV-Alexa Fluor 488 apoptosis detection kit, SYTO 16 (Molecular probes, США).
Цитотоксические реагенты
Актиномицин D, NaOCl, H2O2, GSNO, 1-пропамин, 3-(2-гидрокси-2-нитрозо-1-пропилгидразин) PAPA-NONOaT (Sigma, США).
Прочие реактивы, использованные в работе:

FIEPES, NaHhPO,*, Na?IIP04 , QuantiPro ВСА Assay Kit, диметилсульоксид (DMSO), 10-(2,5-дигидро-2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)-9-метокси-3-оксо-, метиловый эфир ЗН-нафтол[2,1-Ь]пиран-с-карбоновой кислоты, ThioGlo (Sigma, США), набор для определения каспазной активности Caspase - 3 Assay kit #2 (Molecular Probes, США), додецил сульфат натрия (SDS) , глутатион (GSFI) (Fluka), фосфолипиды: 1-пальмитоил-2-олеоил-8п-глицеро-3-[фосфо-Ь-серин] (POPS) - PS, 1-пальмитоил 2-олеоил фосфатидилхолин - PC (Avanti Polar Lipids, США).
Приборы
Конфокальный флуоресцентный микроскоп Nikon ECLIPSE Е-800, программное обеспечение EZ-C1 2.30 Software (Nikon Corporation, Япония). Проточный цитометр Epix