Противоопухолевая и антиметастатическая активность siРНК, РНКазы А и ДНКазы I - препаратов, способных специфически и неспецифически вызывать деградацию нуклеиновых кислот

• Автор: Шкляева, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 161 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 Противоопухолевые препараты на основе ген-направленных нуклеиновых кислот
1.1.1 Механизмы действия противоопухолевых препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот
1.1.1.1 Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов
1.1.1.2 Механизм действия малых интерферирующих РНК (siPHK)
1.1.1.3 Механизм действия рибозимов
1.1.1.4 Механизм действия ''10-23” ДНКазимов
1.1.2 Гены-мишени для лекарственных препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот
1.1.3 Применение препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот в культуре клеток, в экспериментальных моделях животных и в клинической практике
1.1.3.1 Ras
1.1.3.2 C-myc
1.1.3.3 PKC-ct
1.1.3.4 Кластерин
1.1.3.5 Bcl
1.1.3.6 Raf
1.1.3.7 DNMT1
1.1.3.8 RRR2
1.1.3.9 VEGF
1.1.3.10 neu/HER-2 (ErbB-2)
1.1.3.11 Другие гены-мишени
1.2 Ферментативные противоопухолевые препараты на основе рибонуклеаз
1.2.1 Возможные механизмы цитотоксического действия РНКаз
1.2.2 Применение BS-РНКазы для терапии опухолей
1.2.3 Применение онконазы для терапии злокачественных заболеваний в эксперименте и в клинике
1.2.4 Химически модифицированные РНКазы
1.2.5 Мутантные РНКазы

1.2.6 Химерные РНКазы
1.2.7 Тандемные РНКазы
1.3 Активация лекарственного средства через трансдукцию опухолевых клеток генами-самоубийцами
1.4 Восстановление функции генов-супрессоров опухоли
1.5 Иммуногенная терапия
1.6 Заключение
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы и препараты
2.1.2 Оборудование
2.1.3. Плазмиды
2.1.4 Олигонуклеотиды
2.1.5 Буферы и растворы, использованные в работе
2.1.6 Лабораторные животные и опухолевые модели
2.2 Методы
2.2.1 Гель-электрофорез
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
2.2.2 Получение первичных культур опухолевых клеток из асцитной жидкости
2.2.3 Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.4 Определение уровня экспрессии генов в опухолевых клетках методом ОТ-ПЦР

2.2.4.1 Обратная транскрипция
2.2.4.2 ПЦР
2.2.5 Приготовление дуплексов siPHK
2.2.6 Трансфекция клеток siPHK in vitro
2.2.7 Трансфекция клеток siPHK ex vivo
2.2.8 Определение чувствительности клеток к действию цитостатиков (МТТ тест)
2.2.9 Определение чувствительности опухолей LS, RLS и RLS„0 к химиопрепаратам
in vivo
2.2.10 Исследование терапевтического потенциала терапии, включающей трансфекцию опухолевых клеток siPHK ex vivo и in vivo и лечение цитостатиками
2.2.10.1 Ex vivo
2.2.10.2 In vivo

2.2.11 Введение радиоизотопной метки в состав РНК и ДНК с использованием полинуклеотидкиназы
2.2.12 Исследование активности РНКазы A in vitro
2.2.13 Исследование активности ДНКазы I in vitro
2.2.14 Инактивация РНКазы А
2.2.15 Исследование каталитической активности РНКазы А после её инактивации
2.2.16 Инактивация ДНКазы I
2.2.17 Исследование каталитической активности ДНКазы I после её инактивации
2.2.18 Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме крови
2.2.18.1 Получение образцов плазмы крови у мышей
2.2.18.2 Выделение внеклеточных нуклеиновых кислот и определение их концентрации в плазме крови
2.2.18.3 Определение суммарной ДНКазной и РНКазной активности плазмы крови
2.2.19 Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности РНКазы А и ДНКазы I in vivo
2.2.19.1 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А на модели LLC с применением широкого диапазона доз фермента
2.2.19.2 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А и ДНКазы I на моделях LLC и НА
2.2.19.3 Исследование а нти мета статического действия смеси РНКазы А и ДНКазы
I на модели LLC
2.2.19.4 Исследование онкосупрессивного действия инактивированных ферментов РНКазы А и ДНКазы I на модели LLC
2.2.20 Гистология
2.2.21 Статистический анализ
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ siPHK, РНКазы А и ДНКазы I - ПРЕПАРАТОВ, СПОСОБНЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИ ВЫЗЫВАТЬ ДЕГРАДАЦИЮ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)
3.1 Противоопухолевый потенциал siPHK в комбинации с химиотерапией
3.1.1 Описание субштаммов лимфосарком LS и RLS
3.1.2 Сравнение профиля экспрессии генов, вовлечённых в формирование синдрома МЛУ, в клетках опухолей LS и RLS и их чувствительности к цитостатикам
3.1.3 Определение уровня экспрессии генов в клетках опухолей LS и RLS
3.1.4 Селекция высокорезистентной клеточной линии RLS40

яичников [124] и аденокарциномы толстого кишечника [125] продемонстрировало стабилизацию заболевания приблизительно в 25% случаев.
1.1.3.7 DNMT1
In vitro. Метилирование 5’ CpG островков в последовательности генов-супрессоров ферментом ДНК-метилтрансферазы DNMT1 является распространённой особенностью онкологического генотипа клетки [131]. Для специфического ингибирования этого фермента в раковых клетках был разработан 2’-0-метильный фосфотиоатный asON MG98. Было показано, что подавление экспрессии DNMT1 под действием asON приводит к деметилированию промотора гена р16, восстановлению его активности, накоплению гипометилированной формы гена ретинобластомы и ингибированию пролиферации раковых клеток [134].
In vivo. В экспериментах in vivo asON MG98 вызывал существенное замедление роста и регрессию гетеротрансплантатов карциномы кишечника и немелкоклеточного рака лёгких. Успешные прекпинические исследования обеспечили применение MG98 в клинических исследованиях [219]. Фаза I клинических испытаний была направлена на исследование токсичности и фармакологического профиля asON MG98. Внутривенное введение препарата пациентам с различными солидными опухолями в дозе 80 мг/м2/день в течение 21 дня каждые 4 недели оказалось сравнительно безопасным [219]. Однако какого-либо видимого противоопухолевого эффекта отмечено не было. Более высокие дозы препарата, вводимые по предложенной схеме оказались плохопереносимыми для пациентов [219, 220]. В фазе II клинических испытаний проводили тестирование усовершенствованной схемы введения препарата пациентам с метастатической почечной карциномой: 360 мг/м2 дважды в неделю в течение 3 недель [135]. Однако лечение по такой схеме также не дало положительной реакции у пациентов. Исследователи объясняют неудачу неподходящим выбором типа онкологического заболевания [135].
1.1.3.8 RRR2
In vitro. Исследование фосфотиоатного asON GTI-2040, мишенью для которого является мРНК RRR2, показало, что под действием олигонуклеотида мРНК RRR2 практически полностью исчезает в клетках карциномы лёгких человека и существенно снижается в клетках мочевого пузыря человека и в клетках фобросаркомы мышей [143].
Duxbury с соавторами исследовали способность siPHK увеличивать чувствительность аденокарциномы поджелудочной железы человека, имплантированной мышам, к гемцитабину, подавляя экспрессию субъединицы RRR2. Специфические молекулы siPHK, адресованные к мРНК гена RRR2, существенно повышали гемцитабин-индуцированную цитотоксичность [221].