+
Действующая цена700 499 руб.
Товаров:
На сумму:

Электронная библиотека диссертаций

Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО

Расширенный поиск

Оптимизация получения комплексов пептидов с рекомбинантным HSP70 человека для повышения иммуногенности белковых антигенов

  • Автор:

    Черников, Владимир Александрович

  • Шифр специальности:

    03.00.04

  • Научная степень:

    Кандидатская

  • Год защиты:

    2009

  • Место защиты:

    Москва

  • Количество страниц:

    110 с. : ил.

  • Стоимость:

    700 р.

    499 руб.

до окончания действия скидки
00
00
00
00
+
Наш сайт выгодно отличается тем что при покупке, кроме PDF версии Вы в подарок получаете работу преобразованную в WORD - документ и это предоставляет качественно другие возможности при работе с документом
Страницы оглавления работы

Список сокращений
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований
1.1. пассивная иммунотерапия
1.2. активная иммунотерапия и противоопухолевые вакцины
1.3. противоопухолевые вакцины: проблемы и перспективы
2. Белки теплового шока 70кДа и их внутриклеточные функции
2.1. Молекулярная структура белков семейства НБР70
2.2. Номенклатура генов белков семейства Н8Р70
2.3. Функции Н8Р70 внутри клетки
2.4. Механизм связывания пептидов с Н8Р70
3. Внеклеточные функции НБР70
3.1. Механизмы выхода Н8Р70 из клеток
3.2. Иммунологические функции НБР70
3.3. Стратегии создания вакцин на основе НБР70
И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Методы исследования
1. Получение мРНК и кДНК генов семейства НБР70 человека
2. Конструирование экспрессиониых векторов
2.1. Амплификация ДНК 3
2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и экстракция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
2.3. Рестрикция плазмид
2.3.1. Рестрикция плазмиды р11С19 БтаГ рестриктазой
2.3.2. Рестрикция плазмид риС19-Н8Р70_1, рИС19- Н8Р70 II, риС19-ШС70_1 и риС19- Н8С70_Н рестриктазами РэП и НтсНП

2.3.3. Рестрикция плазмиды pQE80L рестриктазами BamHI и Hindill
2.3.4. Рестрикция плазмид PUC19-HSP70Aib, pUC19-HSP70HYB. pUC19-HSC70 и PUC19-HSC70hyb рестриктазами BamHI и Hindill
2.4. Дефосфорилирование рестриктированной Smal плазмиды pUC19
2.5. Фосфорилирование фрагментов ДНК
2.6. Лигирование
2.7. Получение компетентных клеток и их трансформация
2.8. Выделение плазмид методом щелочного лизиса
3. Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков
4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы штаммов-продуцентов E.coli
5. Определение спектральных характеристик белков
5.1. Измерение спектральных характеристик белков при различных значениях
pH среды
5.2. Измерение спектральных характеристик белков при взаимодействии
с пептидами
6. Определение АТРазной активности рекомбинантных белков
7. Получение комплексов рекомбинантных белков HSP70 с синтетическими пептидами
7.1. Получение меченых F1TC синтетических пептидов
7.2. Получение комплексов индивидуальных пептидов с HSP70
7.3. Получение комплексов смеси меченого и немеченого пептидов с HSP70hyb
7.4. Получение комплексов смеси немеченых пептидов с HSC70
8. Определение кинетических характеристик HSP70
9. Получение комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток
9.1. Получение пептидной фракции лизата опухолевых клеток
9.2. Получение комплексов пептидной фракции лизата опухолевых клеток с HSP70
10. Анализ клеточных пептидов, образующих комплексы с HSP70
11. Анализ индукции цитотоксической активности Т лимфоцитов
11.1. Культивирование клеток 4

11.2. Получение дендритных клеток
11.3. Анализ фенотипа ДК
11.4. Нагрузка ДК опухолеспецифическими антигенами
11.5. Индукция специфических цитотоксических лимфоцитов
11.6. Определение цитотоксической активности ЦТЛ
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клонирование генов семейства Н8Р70 в экспрессионных плазмидных векторах
2. Получение рекомбинантных белков
3. Исследование спектральных характеристик рекомбинантных Н8Р70
4. Исследование динамики связывания рекомбинантных Н8Р70 с пептидами
5. Исследование АТР-азной активности Н8Р70
6. Исследование влияния различных параметров на связывание Н8Р70
с пептидами
7. Исследование взаимодействия Н8Р70 со смесью пептидов
8. Исследование взаимодействия Н8Р70 с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток
9. Исследование цитотоксической активности
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список литературы

Состав полученного раствора анализировали методом ВЭЖХ на колонке с сорбентом С|8. Пептиды элюировали градиентом (от 0 до 100%) растворителей 0.1% TFA - ацетонитрил. Детекцию проводили при длине волны 495 нм. Цифровые данные экспортировали в виде текстового документа с кодировкой ANSI и анализировали с помощью ПО OriginPro 8.0.
11. Анализ индукции цитотоксическон активности Т лимфоцитов.
11. 1. Культивирование клеток.
Клетки Т-В-клеточной гибридомы линии Т2 и клетки эритролейкоза человека линии К562 культивировали в пластиковых флаконах (“Costar”, США) в среде RPMI 1640 (“Sigma”, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФСК, “Gibco”,CIlJA) и 100 мкг/мл гентамицина в увлажненной среде при температуре 37°С в С02 инкубаторе при содержании СОг 5%.
Для подготовки клеток линии Т2 к использованию в качестве мишеней в экспериментах по определению цитотоксической активности лимфоцитов проводили культивирование клеток в среде, содержащей 3Н-тимидин (3 мкКи/мл, удельная радиоактивность 80 Ки/ммоль, “Изотоп”, Россия) в течение 18 часов. Перед использованием клеток линии Т2 в качестве специфических мишеней проводили 3-х часовую инкубацию клеток с пептидом PSMA (60 мкг/мл) в бессывороточной среде AIM-V (“Gibco”,CIIIA) в С02.
11.2.Получение дендритных клеток.
ДК выделяли из моноцитов периферической крови здоровых доноров как описано ранее [169]. Используя градиентное центрифугирование лейковзвеси через раствор фиколла IIistopaque-1077 (“Sigma”, США), выделяли фракцию мононуклеарных лейкоцитов. Полученные клетки промывали раствором Версена и ФСБ, осаждая центрифугированием при 250 g, 175 g, и 110 g по 15 мин при комнатной температуре. Затем клетки вносили в чашки Петри (d= 85 мм) в концентрации 50x106 клеток на чашку в 10 мл RPMI1640 с добавлением 10% инактивированной ФСК, 100 мкг/мл гентамицина (полная культуральная среда - ПКС) и инкубировали в СОг-инкубаторе в течение 2 часов. Прилипание клеток контролировали с помощью микроскопии. Не прикрепившиеся клетки удаляли и добавляли 10 мл свежей ПКС (день “0”). Отобранные лимфоциты центрифугировали, замораживали в среде, содержащей 90% ФСК и 10% ДМСО, и хранили в жидком азоте. Прикрепившиеся клетки культивировали до дня “1”, отбирали 3 мл среды и добавляли 3 мл свежей ПКС, содержащей ГМ-КСФ (10000 ед) и ИЛ-4 (10000

Рекомендуемые диссертации данного раздела

Время генерации: 0.114, запросов: 967