Изучение механизмов адсорбции белков плазмы крови на поверхности эмульсий перфторуглеродов, стабилизированных блоксополимерами полиоксиэтилена-полиоксипропилена

• Автор: Жалимов, Виталий Касимович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л Мелкодисперсные эмульсии на основе ПФОС, пригодные для внутривенного введения
1.2 Применение эмульсий на основе ПФОС
1.3 Биологическая активность ПФОС и эмульсий ПФОС
1.4 Выведение эмульсий ПФОС из кровотока
1.5 Сорбция белков на поверхности субмикронных дисперсных сред
1.6 Влияние свойств белков на их адсорбцию
1.7 Влияние свойств поверхности на белковую адсорбцию
1.8 Поведение белковых молекул при адсорбции
1.9 Изменение конформации белка при адсорбции
1.10 Овершут в кинетике адсорбции
1.11 Структура и функции АроАІ
1.12 Структура и функции ApoJ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы
2.1.2 Красители
2.1.3 Антитела
2.2 Методы
2.2.1 Состав и приготовление экспериментальных ПФУ эмульсий
2.2.2 Методы работы с животными
2.2.3 Определение концентрации ПФОС в крови кролика после внутривенного введения методом 19F—ЯМР-спектроскопии
2.2.4 Определение концентрации белка в супернатанте при отмывке эмульсии от неадсорбированных белков
2.2.5 Определение времени насыщения эмульсии белками плазмы человека in vitro
2.2.6 Определение зависимости максимальной сорбционной емкости эмульсии по белкам от соотношения инкубационных объемов эмульсии и плазмы крови человека и кролика in vitro
2.2.7 Динамика изменения сорбционной емкости эмульсии от времени циркуляции в кровотоке кролика
2.2.8 Определение количества белка, адсорбированного на эмульсии в экспериментах in vitro и in vivo
2.2.9 Электрофорез
2.2.10 Экстракция липидов плазмы крови человека
2.2.11 Очистка ApoAI
2.2.12 Насыщение эмульсии белками плазмы
2.2.13 Отмывка эмульсии от адсорбированных плазменных белков водными растворами веществ, деадсорбирующих эти белки
2.2.14 Определение точки начала агрегации плазменных белков
2.2.15 Идентификация белков
2.2.16 Иммуноблоттинг
2.2.17 Измерение флуоресценции
2.2.18 Исследование адсорбции ApoAI в реальном времени
2.2.19 Методы in silico
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Усовершенствование метода выделения адсорбированных на частицах эмульсии белков плазмы
3.2 Определение оптимального времени инкубации эмульсии с плазмой
3.3 Влияние ПАВ и гидрофобного ядра на адсорбцию плазменных белков
3.4 Механизмы адсорбции белков на эмульсии
3.4.1 Выявление плазменных белков, сорбция которых происходит в результате электростатического взаимодействия
3.4.2 Выявление плазменных белков, сорбция которых происходит в результате гидрофобного эффекта
3.4.3 Влияние липидов в составе ApoAI на его сорбцию
3.4.4 Теоретический анализ возможных путей адсорбции ApoAI на поверхности ПФУ эмульсии

3.4.5 Изучение влияния адсорбции на флуоресценцию ApoAI
3.4.6 Динамика затухания флуоресценции ApoAI в процессе адсорбции на поверхности ПФУ эмульсии
3.4.7 Влияние ПФУ на флуоресценцию белков плазмы человека, связанных с поверхностью частиц эмульсии по гидрофобному типу
3.5 Сорбционная емкость эмульсии
3.5.1 Зависимость сорбционной емкости от соотношения эмульсии к плазме
3.5.2 Сорбционная емкость эмульсии по белкам плазмы кролика в условиях in vivo
3.5.3 Расчет сорбционной емкости эмульсии по белкам плазмы человека in vivo на основании соотношения данных по емкости in vitro для кролика и человека
3.5.4 Биологическое значение сорбции плазменных белков на частицах эмульсии
3.6 Использование эффекта сорбции белков на поверхности ПФУ эмульсий для препаративной очистки белков
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
Для проведения экспериментов по адсорбции, а также при очистке белков использовалась цитратная плазма человека, полученная не менее чем от 30 индивидов. Время хранения плазмы при температуре -28°С не превышало 2-х недель.
2.1.1 Реактивы
BSA (Sigma, США), СДС (Рапгеас, Испания), трисгидроксиметиламинометан (Bio-Lab Ltd, Израиль), глицин (Reanal, Венгрия), мочевина (Carl Roth, Германия), натрий уксуснокислый (Химмед, Россия), фторид натрия (Химмед, Россия), Tween 20 (Ferak, Германия), хлорид натрия (Рапгеас, Испания), d-триптофан (Sigma, США), азид натрия (Sigma, США), глицерин (Merck, США), Triton Х-305 (Ferak, Германия), буфер для электрофореза (Fermentas, Литва и Sigma, США), 2-меркаптоэтанол (Carl Roth, Германия), бисакриламид (Sigma, США), акриламид (Carl Roth, Германия), TEMED (Fluka, Швейцария), персулфат аммония (Carl Roth, Германия), дитиотреитол (Dudley Chemical, США), PMSF (Sigma, США), d-триптофан (Sigma, США), проксанолы 268 и 168 (Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей), Synperonic® F-108 (F-108) (Fluka Analytical, Франция), Pluronic® Р-123 (Fluka Chemistry, Германия), пер фтор декалин (ОАО “Кирово-Чепецкий хим. комбинат им. Б.Г1. Константинова”, Россия), перфторметилциклогексилпиперидин (филиал ГИПХ, Пермь, Россия), R-113 (Кирово-Чепецкий химкомбинат, Россия), уксусная кислота (Рапгеас, Испания), маркеры молекулярных масс (Fermentas, Литва), также использовали соли и кислоты отечественного производства “Реахим” марок “ЧДА” и “XT’.
2.1.2 Красители
Ponceau S (Helicon, Россия), Coomassie G-250 (Helicon, Россия), бромфеноловый синий “чда” (Реахим, Россия).