Обнаружение новой бактериальной системы рестрикции-модификации BstF5I и изучение структуры ДНК-метилтрансфераз этой системы

• Автор: Абдурашитов, Мурат Абдурашитович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
II. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДНК-МЕТИЛ-ТРАНСФЕРАЗ (Обзор литературы)
2.1. Распространение систем рестрикции-модификации и ДНК-метилтрансфераз у прокариот
2.2. Классификация систем РМ
2.2.1. Тип II
2.2.2. Тип ПБ
2.2.3. Тип ПО
2.2.4. Типі
2.2.5. Тип I 1/2
2.2.6. Тип Вс2
2.2.7. Тип III
2.2.8. Тип IV
2.3. Функции ДНК-метилтрансфераз
2.3.1. Защита от гидролиза изоспецифичными эндонуклеазами 1 б
2.3.1.1. Участие в бактериальных системах РМ
2.3.1.2. Обеспечение трансфекции и трансдукции
2.3.2. Маркировка родительской цепи в тиШЬБ-подобных
системах репарации
2.3.3. Другие известные функции
2.4. Классификация ДНК-метилтрансфераз по первичной структуре
2.5. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз
2.5.1. АсІоМеІ-связьівагощий домен
2.5.2. Мишень-узнающий домен

2.6. Механизмы связывания субстрата и узнавания специфичной последовательности ДНК
2.6.1. Связывание с сайтом узнавания
2.6.2. Конформационные изменения участков пептидной цепи метилаз при связывании субстрата
2.7. Механизмы катализируемой реакции
2.7.1. «Выворачивание» модифицируемого основания
2.7.2. Перенос метальной группы на основание ДНК 3 б
2.7.2.1. 5тС метилирование
2.7.2.2. Ы4тС и ИбшА метилирование
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеризация эндонуклеазы рестрикции 7МБ51
3.1.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции 55/Е51 и определение
оптимальных условий гидролиза ДНК
3.1.2. Определение субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции ВУЕ51
3.1.3. Определение позиций расщепления
3.1.4. Возможные родственные связи эндонуклеазы рестрикции
5.51 с другими эндонуклеазами рестрикции
3.1.5. Предлагаемая схема практического использования новой
эндонуклеазы рестрикции
3.2. Нуклеотидная последовательность генов ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации &/Т51
3.2.1. Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз системы
рестрикции-модификации &УЕ51
3.2.2. Объединение данных по нуклеотидным
последовательностям трех вставок
3.2.3. Выявление открытых рамок трансляции и их анализ

3.2.3. Структура спейсерного участка между генами
Ъф1М-1 и Ъф1М
3.2.4. Идентификация функции кодируемых белков на основе
их аминокислотного состава
3.3. Характеризация ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации ВяЯ
3.3.1. ДНК-метилтрансфераза
3.3.1.1. Выделение и оптимизация
3.3.1.2. Определение модифицируемого основания
3.3.2. ДНК-метилтрансфераза &Л
3.3.2.1.Сопоставление с пространственной
структурой М.РрпМ
3.3.2.2.Анализ участков последовательностей метилаз группы М.ОрпМ, предположительно
взаимодействующих с ДНК
3.3.3. ДНК-метилтрансферазаДуЛ
3.3.3.1. Экспрессия гена и выделение ДНК-метилтрансферазы М.ДуЛ
3.3.3.2. Определение модифицируемой цепи
3.4. Избыточность ДНК-метилтрансфераз в системе рестрикции-модификации B.stF5]
IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

2.7.1. «Выворачивание» модифицируемого основания
Для двух С5-ДНК-метилтрансфераз (Нка и Нае III), чьи пространственные структуры были определены в комплексе с короткими олигонуклеотидами, наблюдается внеспиральное расположение модифицируемого основания [91, 77]. Цитозиновое основание в этих комплексах поворачивается на 180° через малую бороздку ДНК в полость каталитического субдомена фермента (Рис. 8). Это нарушение структуры ДНК не влияет на контакты аминокислотных остатков Т1Ш с основаниями, входящими в сайт узнавания фермента, которые осуществляются в большой бороздке двойной спирали. Исходя из сходной доменной организации кристаллографически изученных ДНК-метилтрансфераз, предполагается, что все ферменты данного типа модифицируют основания в экстраспиральном положении [95].
Рис. 8. Две проекции ДНК-метилтрансферазы Нка в комплексе с ДНК, демонстрирующие внеспиральное положение метилируемого цитозинового основания.