Выделение новой ДНК-полимеразы репаративного типа из яйцеклеток костистой рыбы Вьюн (Misgurnus fossilis L. )

• Автор: Димитрова, Диана Димитрова
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Повреждения в ДНК и факторы, их вызывающие
2.2. Механизмы репарации ДНК
2.2.1. Эксцизионная репарация основания
2.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидного остатка
2.3. Репаративные ДНК-полимеразы
2.3.1 ДНК-полимераза р
2.3.2. ДНК-полимеразы 5 и
2.3.3. ДНК-полимераза а
2.3.4. ДНК-полимеразаС
2.4. ДНК-полимеразы в раннем развитии животных
2.5. Окислительный стресс и репарация ДНК
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Источник и квалификация основных реактивов и ферментов
3.2. Получение биологического материала
3.3 Фракционирование ДНК-полимераз
3.3.1. Получение препаратов репаративных ДНК-полимераз для исследования динамики их активности в эмбриогенезе
3.3.2. Получение очищенных препаратов ДНК-полимераз р и С,
из икры вьюна для седиментационного анализа
3.4. Получение ДНК-субстратов
3.4.1. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 3Н с З'-конца
3.4.2. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 32Р с 5'-конца
3.5.1. Определение активности ДНК-полимераз
3.5.2. Определение активности 3'->5' и 5'->-3'-экзонуклеазы
3.6. Определение процессивности ДНК-полимераз
3.7. Другие методы
3.7.1. Электрофоретическое разделение белков и
нуклеиновых кислот
3.7.2. Электрофорез ферментов в неденатурирующем полиакриламидном геле
3.7.3. Определение концентрации белка и соли
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Выделение репаративных ДНК-полимераз из зрелых
яйцеклеток вьюна
4.2. Полипептидный состав ДНК-полимеразы (3
4.3. Полипептидный состав ДНК-полимеразы С,
4.4. Энзиматическая характеристика ДНК-полимеразы С
4.4.1. Матричные свойства
4.4.2. Процессивность

4.4.3. 3'->5'-экзонуклеазная активность

4.4.4. Ингибиторный анализ
4.5. Изменение активности ДНК-полимераз (3 и С в раннем

развитии вьюна
4.6. Влияние окислительного стресса на ДНК-полимеразы в

эмбриогенезе вьюна
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Репаративные ДНК-полимеразы в эмбриональном развитии
5.2. Характеристика ДНК-полимеразы С, из зрелых

яйцеклеток вьюна
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АР-сайт - апуриновый/ апиримидиновый сайт
БСА - бычий сывороточный альбумин
он ДНК - однонитевая дезоксирибонуклеиновая кислота
дн ДНК - двунитевая дезоксирибонуклеиновая кислота
«Да -килодальтон
o.e. - оптическая единица
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
н.о. - нуклеотидные остатки
ПААГ - полиакриламидный гель
ТЕМЕД - N, N, N, N, - тетраметилэтилендиамин
Трис - трис-(оксиметил)-аминометан
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ЭРО - эксцизионная репарация основания
ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидного остатка
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
А, G, С, U, Т - (в нуклеотидах и нуклеозидах) аденозин, гуанозин, цитидин,уридин, тимидин BuAdATP - бутил-анилин-дезоксиаденозин-5'-трифосфат BuPhedGTP - бутил-фенил-дезоксигуанозин-5'-трифосфат DMSO - диметилсульфоксид Ds-Na - додецилсульфат натрия
dNMP, dNTP - дезоксинуклеозид-5'-монофофат, -трифосфат d2TTP - 2', 3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат dRp - дезоксирибофосфат
PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
PPi - пирофосфат
RF-C - репликативный фактор С
RP-A - репликативный белок А
SSB белки - белки, связывающие однонитевую ДНК

изолирована в виде гибридного белка пришитого к глутатион-в-трансферазе (Gst-Rev3p) с суммарной молекулярной массой ~205 кДа. При использовании двухгибридной системы дрожжей обнаружено, что Gst-Rev3p взаимодействует с продуктом гена REV7 с молекулярной массой 29 кДа. ДНК-полимеразная активность комплекса Gst-Rev3p:Rev7p в 30 раз выше и намного стабильнее, чем белка Gst-Rev3p. Комплекс Gst-Rev3p:Rev7p был назван ДНК-полимеразой Его коэффициент седиментации 13 S. Разрезание тромбин-чувствительного сайта в Gst-Rev3p увеличивало всего в два раза ДНК-полимеразную активность белка Rev3p, поэтому все результаты, описанные авторами, получены с использованием более устойчивого комплекса Gst-Rev3p:Rev7p
ДНК-полимераза £ дрожжей - непроцессивный фермент, который обладает 3'->5'-экзонуклеазной активностью. В сравнении с другими ДНК-полимеразами, которые останавливаются, встречая тиминовые димеры в составе ДНК, ДНК-полимераза £ дрожжей “преодолевает” их в 10% случаев. В виду отсутствия корректирующей активности фермента, такой синтез приводит к мутациям. ДНК-полимераза if дрожжей предпочтительнее утилизирует короткие праймер-матрицы. Продукты дистрибутивного синтеза при этом могут иметь длины до 200 н.о. ДНК-полимераза £ дрожжей нечувствительна к афидиколину подобно ДНК-полимеразам (3 и у и также нечувствительна к d2TTP. К BuAdATP она слабо чувствительна (при ЮмкМ -72% остаточная активность). Фермент практически неактивен на активированной ДНК, poly(dA)»oligo(dT) и poly(dA)*oligo(A).
Сравнение ДНК-полимеразы из тимуса теленка и ДНК-полимеразы cf дрожжей позволяют сделать вывод о том, что это разные ферменты, так как чувствительность к ингибиторам и энзиматические свойства этих ферментов принципиально различаются. Эти ферменты предпочитают различные