Упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК

• Автор: Матц, Михаил Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 60 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Различные стратегии дифференциального дисплея и
области их применимости (обзор литературы)
1.1. Общая характеристика дифференциального дисплея
1.2. Две основные стратегии дифференциального дисплея
1.3. Классический дифференциальный дисплей
1.4 Методы систематического дифференциального дисплея
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Принцип метода
2.2. Поиск региональных молекулярных маркеров планарии
2.3. Чувствительность УДД
2.4. Поиск различий в генной экспрессии между внутригнездовыми муравьями и муравьями-фуражирами - воспроизводимость УДД
2.5. Влияние сложности образца кДНК на эффективность УДД
2.6. Сверх-представленные транскрипты и виртуальная 32 нормализация
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1.Материалы и оборудование
3.2. Методы исследования
3.2.1. Протокол упорядоченного дифференциального дисплея 38 кДНК
3.2.2. ОТ-ПЦР
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Методы, направленные на идентификацию транскриптов дифференциально экспрессирующихся генов (Т-ДЭГ, то есть мРИК, представленных в разной концентрации в сравниваемых образцах), представляют итерес для целого ряда областей биологии - эмбриологии, клеточной биологии, иммунологии и других. Кроме того, в настоящее время изучение ДЭГ становится одной из основных задач крупномасштабных геномных проектов.
Технические подходы, предназначенных для сравнения выделенных препаратов РНК in vitro с целью поиска Т-ДЭГ, несмотря на чрезвычайное разнообразие, имеют одну основу: метод дифференциальной гибридизации, или дифференциального скрининга (Rebagliati et at., 1985). Не вдаваясь в подробности, можно сказать, что он состоит в проверке уровня представленности случайно выбранных последовательностей (клонов) кДНК в сравниваемых образцах РНК с помощью гибридизации. Целью при этом является обнаружение последовательностей, присутствующих в одном из сравниваемых образцов РНК в гораздо большей концентрации, чем в другом. Самое очевидным неудобством этого метода была огромная трудоемкость: поскольку популяция Т-ДЭГ редко составляет более 1% от всей РНК, на каждый обнаруженный Т-ДЭГ могли приходиться сотни раундов гибридизации с общими последовательностями. Чтобы преодолеть это затруднение, был предложен прием вычтиающей гибридизации, целью которого является обогащение сравниваемых образцов Т-ДЭГ перед собственно дифференциальным скринингом. Было разработано (и успешно применено) множество вариантов техники вычитающей гибридизации.
В 1992 году был предложен альтернативный подход к дифференциальному скринингу (Liang and Pardee, 1992; Welsh et al., 1992), который теперь известен под общим названием "дифференциальный дисплей" (ДД). В общем, он состоит из следующих стадий: (а) из каждого из сравниваемых образцов РНК производятся упрощенные образцы фрагментов «ДНК (т.е. включающие только небольшую часть из всех исходно имеющихся кДНК) таким образом, что их состав жестко определяется конкретными условиями их получения; такие образцы называются суб-популяциями; (б) аналогичные суб-популяции, полученные из сравниваемых образцов РНК, разделяются на соседних дорожках полиакриламидного геля (получаемые картинки из исторических соображений называются фингерпринтами); (в) полосы фрагментов «ДНК, видимые только в одном из сравниваемых образцов (или гораздо более выраженные в одном образце чем в другом) вырезаются из геля и изучаются (такие фрагменты и происходят из Т-ДЭГ); (г) изменяя параметры получения суб-популяций, производятся суб-популяции другого состава и изучаются вышеописанным образом, чтобы сравнить уровень экспрессии для возможно большего числа генов. Преимущество такого подхода по сравнению с дифференциальным скринингом очевидно: вместо проведения отдельного раунда гибридизации для каждой из случайно выбранных последовательностей, сравнивается уровень представленности сразу нескольких десятков видов мРНК. Еще одним очень важным свойством ДД является возможность совместно анализировать более двух образцов РНК, что практически невыполнимо в случае дифференциального скрининга с использованием вычитающей гибридизации. В последующие годы ДД очень широко применялся для решения разнообразных задач, что привело к появлению нескольких сотен публикаций. Тем не менее выяснилось, что техника
Анализ аминокислотных последовательностей, соответствующих нуклеотидным последовательностям выявленных нами региональных генетических маркеров, показал, что последовательность 2а включает два углеводсвязывающих домена, характерных для пектинов С-типа и высокогомологичных между собой, а также с углеводсвязывающими доменами, входящими в состав полипептида, кодируемого ранее идентифицированным нами у планарии геном scarf (Bogdanova et al., 1998; детальное изучение транскрипта 2а составило предмет отдельного научного проекта и не входит в рамки данной работы); За кодирует цинк-зависимую карбоксипептидазу, Зс -металлопротеиназу астацинового типа (Рис. 7А, и Б соответственно). Полипептид, соответствующий последовательности ЗЬ, содержит лидерный пептид, участок, гомологичный ДНК-связывающим доменам HMG-класса и сигналы ядерной локализации, однако не может быть отнесен ни к одному из известных семейств белков (Рис. 7Г). Для транскрипта Зс была определена полная нуклеотидная последовательность кДНК и последовательность участка промоторной области, прилежащего к сайту старта транскрипции (Рис. 8). Для этого применялись, соответственно, метод амплификации флангов кДНК Marathon (Chenchik et al., 1996) и метод прогулки по геному при помощи ПЦР (Siebert et al., 1995). Для остальных последовательностей не было выявлено значимых гомологий с известными аминокислотными последовательностями.
2.3 Чувствительность УДД
Относительную представленность последовательностей 2а и За в исходных образцах кДНК оценили с помощью PCR: в качестве эталона использовали последовательные разведения известного количества ДНК данного