Изучение биологических активностей мутантных форм белка р53

• Автор: Пугачева, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Содержание
Список сокращений
1. Обзор литературы
Введение
1.1 Общая характеристика антионкогена р53
1.1.1. Молекулярная организация гена р53
1.1.2. Мутации гена р53 в опухолях человека
1.1.3. Доменная организация белка р53
1.1.4. Рентгеноструктурный анализ р53
1.2. Биологические активности белка р53
1.2.1. Белок р53 транскрипционный активатор и репрессор
1.2.2.Участие р53 в регуляции сверочных точек клеточного цикла
1.2.2.1. Регуляция G1/S перехода клеточного цикла. Р53-зависимый G1 арест
1.2.2.2. Р53-зависимый G2 арест
1.2.3. Гены-мишени р53 и р53-зависимого апоптоза
1.2.4. Гены-мишени р53, функция которых не выяснена
1.3. Активация и ингибирование транскрипционного фактора - р53
1.3.1. Взаимодействие с клеточными белками Mdm2, JNK, WT1 и ATM
1.3.2. Коактиваторы р53
1.3.3. Взаимодействие р53 с вирусными онкобелками
1.3.4. Пострансляционные модификации р53
1.3.4.1. Фосфорилирование

1.3.4.2. Ацетилирование р53
1.4. Системы деградации р53
1.5. Биологические активности мутантных форм белка р53
1.5.1. Кооперация мутантного белка р53 с онкогенами
1.5.2. Участие мутантного р53 в иммортализации клеток
1.5.3. Позитивная регуляция синтеза ДНК мутантным белком р53
1.5.4. Взаимодействие мутантного р53 с белками теплового шока
1.5.5. Специфическое связывание мутантного р53 с рядом клеточных белков
1.5.6. Взаимодействие мутантных форм белка р53 с ДНК
1.5.7. Характеристика трансактивирующих активностей мутантных форм р53
1.6. Конформации мутантных форм белка р53
1.7. Мутантный р53-доминантный или рецессивный онкоген
1.8. Стабилизация мутантного белка р53
1.9. Субклеточная локализация белка р53
2. Материалы и методы
2.1. Культивирование клеточных линий
2.2. Получение панелей линий клеток человека и мыши, экспрессирующих р53 дикой и мутантных форм под контролем гормон-зависимого или
тетрациклин-регулируемого промотора
2.3. Иммунопреципитация
2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле
2.5. Перенос белков из гелей на нитроцеллюлозные фильтры и
иммунодетекция р53
2.6. Бактериальные штаммы, плазмиды, ретровирусные вектора

2.7. Получение компетентных клеток ОН5
2.8. Выделение плазмидной ДНК
2.8.1. Препаративное выделение плазмидной ДНК
2.8.2. Аналитическое выделениеплазмидной ДНК
2.9. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.10. Фракционирование ДНК в агарозных гелях
2.11. Извлечение ДНК из агарозных гелей
2.12.Субклонирование фрагментов ДНК в вектора рРБ-пео, р81Т-пео, рММТУ
2.12.1. Получение векторной ДНК
2.12.2.Реакция лигирования
2.13. Трансформация компетентных клеток Е.СоН плазмидной ДНК
2.14. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструктов методом кальций-фосфатной преципитации
2.15. Определение эффективности трансфекции и инфекции
по флюорисценции зеленого белка
2.16. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами
2.17. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.18. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера
2.19 Экстракция РНК и Мойет-блотгинг. £
2.20. Метод субтрактивной гибридизации
2.21 Выделение высокомолекулярной ДНК
2.22 Гибридизация по Саузерну
2.23. Анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (САТ-реакция)
2.24. Просчет радиоактивности в пробах

результате гипоксии приводит к быстрой деградации р53 (9) через протеосомы. Образование комплекса HEFl-a и р53 приводит к ингибированию HIF1-зависимой транскрипции. Ингибирование не связано с трансактивационной активностью р53. Мутантный р53 His273, несвязывающийся с ДНК и не трансактивирующий гены мишени р53 тем не менее способен ингибировать HIFI-зависимую трансактивацию (20). Как р53 так и HIF1 связываются с рЗОО, который активирует оба транскрипционных фактора (153). Область связывания с р53 в белке рЗОО располагается между 1514-1922 а.о (86), а с HIF1 между 346-410. Образование тройного комплекса р53, HIF1 и рЗОО приводит к ингибированию HIF1-зависимой трансактивации. Мутация рЗОО в области связывания с HIF1 приводит к снятию р53-зависимой супрессии HIF1. Двойной мутант р53 Ser22/Gln23 не свзывается с рЗОО и не способен ингибировать HIF1. Таким образом для ингибирования HIF1 р53 должен свзяаться с рЗОО (20).
Р53-зависимый апоптоз не всегда сязан с трансактивационной активностью р53 (28). В молекуле белка р53 был обнаружен новый функциональный домен необходимый для эффектиной рост-супрессирующей активности р53, но не важен для трансактивации генов-мишеней р53 (259). Данный участок в белке р53 человека находится между 62-91 а.о и представлен пятью мотивами типа РХХР, где Р это аминокислота пролин, а X любая другая. Он необходим для транскрипционно независимого ингибирования роста клеток белком GAS1 (212). Мотивы типа РХХР известны как сайты связывания для белков с SH3 доменом, некоторые из которых являются ингибиторами апоптоза. Однако на сегодняшний день не найден ни один из возможных белков вязывающихся с данным участком р53. Белоки c-Abl и RAC-две рост-ингибирующих тирозиновых киназы, BIN1 -белок связывающийся с протоонкогеном с-мус имееют SH3 домен и связываются с р53, связываются ли они с пролиновым доменом неизвестно. Белок р53 с делецией пролинового домена (62-91) не