Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО
Дубилей, Светлана Алексеевна
03.00.03
Кандидатская
1999
Москва
80 с.
Стоимость:
499 руб.
ОГЛАВЛЕНИЕ.
Используемые сокращения
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Определение перинной структуры нуклеиновых кислот гибридизацией с микрочипом
1.1.1 Секвенирование гибридизацией: методы и возможности
1.1.2 Методы производства микрочипов
1.1.3 Специфичность гибридизации
2. Применение микрочипов в биологических исследованиях
1.2.1 Изучение экспресии и обнаружение новых генов
1.2.2 Детекция мутаций и исследование полиморфизма
1.2.3 Картирование генов и упорядочивание библиотек
1.3 Минисеквенирование
Глава 2. Материалы и Методы
2.1 Использованные приборы и реактивы
2.2 Синтез и очистка олигонуклеотидов
2.3 Приготовление олигонуклеотидных микрочипов
2.3.1 Приготовление микроматриц
2.3.2 Иммобилизация олигонуклеотидов
2.4 Детекция и обработка флуоресцентного сигнала
2.5 Получение ДНК
2.5.1 Полимеразная Цепная Реакция
2.5.2 Фосфорилирование олигодезоксинуклеотидов
2.5.3 Фрагментирование ДНК
2.5.4 Последовательное лигирование гель - иммобилизованных олигонуклеотидов.
2.6 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах
2.6.1 Анализ ДНК методом 3' концевых мисматчей
2.6.2 Анализ ДНК методом прилегающих праймеров
Глава 3. Результаты
3.1 Последовательное лигирование на микрочипе гель-иммобилизованных олигонуклеотидов
3.1.1 Определение длины тетрануклеотидного повтора
3.2 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах
3.2.1 Оптимизация условий реакции
3.2.2 Детекция генов токсинов Bacillus anthracis
3.2.3 Диагностика Р-талассемии
3.2.4 Аплотипирование HLA DQA1
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Благодарности
Список литературы
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
сИЧТР дезоксинукпеотидтрифосфаты
ЕРТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ТЕМЕЭ М,Ы,Ы,Ы-тетраметилэтилендиамин
ПЦР/РСР полимеразная цепная реакция
нт. нуклеотидов
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
Тт температура плавления
ШРАМ флуоресцеин
ТМИ тетраметилродамин
ТР техасский красный
Аи/у.е. условные еденицы
температуре (~22°С) в течение 4 ч. Затем микрочип отмывали от непрореагировавшего пентамера водой 10 мин при 37°С и проводили следующий раунд гибридизации - лигирования.
2.6 Минисеквенирование на олигонуклеотидных микрочипах.
2.6.1 Анализ ДНК методом 3' концевых мисматчей.
Для проведения реакции приготавливали микрочип по методике описанной выше. Количество олигонуклеотида иммобилизовавшегося в элемент чипа варьировали от
0.2 до 1 пмоля на элемент. Реакционная смесь (50 мкл) содержала анализируемую ДНК, 10 мкМ ddATP, ЮмкМ ddCTP, ЮмкМ ddGTP, ЮмкМ ddUTP (DuPont, все дидезоксинукпеотид трифосфаты конъюгированы с флуоресцеином), от 3 до 5 едениц Perfect Match PCR Enhancer (Stratagene), от 5 до ЗО едениц ThermoSequenase DNA polymerase (Amersham) в буфере для ThermoSequenase (Amersham). Концентрация ДНК варьировалась от 0.06 до 6 нМ. Реакционная смесь дегазировалась, наносилась на подогретый до 75°С микрочип и герметично закрывалась камерой для in situ ПЦР (Perkin Elmer Co.). Избыточный расствор (примерно 25 мкл) выдавливался из камеры, микрочип помещался в ПЦР амплификатор (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer Co.). Реакцию проводили от 10 до 360 мин при постоянной температуре от 58 до 74°С. В случае двухцепочечной ДНК проводили дополнительную денатурацию при 95°С в течение 5 мин. После проведения реакции микрочип отмывали от несвязавшейся флуоресцентной метки в 1% Tween 20 в течение 15 мин, затем помещали в прибор для горизонтального электрофореза (Pharmacia Biotech). Отмывку электрофорезом проводили 15 мин при напряжении IOV/см в 0.5х трис-боратном буфере.
Название работы | Автор | Дата защиты |
---|---|---|
Клонирование и изучение S-REX - нового гена со специфической компартментализацией mРНК в нейронах | Бака, Иван Дмитриевич | 1999 |
Исследование функциональных свойств аутоантител к ДНК | Козырь, Арина Владимировна | 1999 |
Двойные и тройные спирали олигодезоксирибонуклеотидов с параллельной ориентацией цепей | Щелкина, Анна Кирилловна | 1997 |