Выявление генов дифференциально экспрессирующихся при регенерации планарий

• Автор: Богданова, Екатерина Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 84 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. Типы репаративной регенерации
1.2. Планарии как модельный объект при иссследованиях регенерации
1.2.1. Морфологические и функциональные особенности пресноводных
планарий
1.2.2. Общие аспекты регенерации планарии
1.3. Молекулярно- биологические иследования регенерации (Методы
идентификации регуляторных генов и их применение к исследованию регнерации)
1.3.1. Методы, основанные на мутационном анализе
1.3.2. Поиск генов с использованием их эволюционного-консерватизма
1.3.3. Ограничения методов поиска генов, основанных на их эволюционном
консерватизме
1.3.4. Методы прямого поиска дифференциально экспрессирующихся генов
1.4. Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Модельный эксперимент
2.2. Получение библиотек кДНК, обогащенных последовательностями
специфически экспрессирующимися в ходе регенерации различной полярности
2.2.1. Стратегия вычитающей гибридизации
2.2.2. Получение образцов амплифицированной кДНК из регенерационных
бластем планарии
2.2.3. Приготовление образцов кДНК трейсера и драйвера
2.2.4. Вычитающая гибридизация
2.3. Дифференциальный скрининг
2.3.1. Описание метода in vitro клонирования

2.3.2. Применение клонирования in vitro для анализа образцов кДНК, 35 обогащенных последоватльностями специфическими для регенерации различной полярности
2.4. Структура выделенных фрагментов
2.4.1. Нозерн-блот гибридизация
2.4.2. Выявление полной кодирующей последовательности кДНК гена scarf
2.4.3. Анализ структуры гена scarf
2.4.4. Scarf - представитель новой группы лектинов С-типа
2.5. Анализ экспрессии генов scarf и collar в теле нерегенерирующих
планарии
2.5.1. Whole mount in situ гибридизация
2.5.2. Анализ распределения мРНК выделенных генов вдоль дорсо
вентральной оси
2.5.3. RT-ПЦР анализ
2.6. Анализ экспрессии генов scarf и collar в ходе регенерации
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Оборудование и материалы
3.2. Методы исследования
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Одно из важнейших свойств живых существ - способность восстанавливать целостность организма после ранения или утраты части тела. Это свойство может быть обнаружено у самых разных животных - от простейших до высших млекопитающих. В отличиии от большинства систематических групп животных, являющихся модельными объектами биологии развития, пресноводные планарии обладают способностью к восстановлению утраченного паттерна даже из небольших фрагментов тела и являются удобным объектом для изучения генетических основ репаративной регенерации.
Одним из наиболее эффективных подходов к пониманию механизмов регенерационных процессов является исследование генов, контролирующих эти процессы.
Целью представляемой работы была идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе регенерации различной полярности (восстановление головной или хвостовой недостающей части тела) и могущих служить генетическими маркерами при изучении процесса восстановления нового паттерна. Для решения этой задачи мы применили стратегию вычитающей гибридизации. В результате нами были сконструированы библиотеки кДНК, обогащенные последовательностями, специфичными для регенерационных почек различной полярности. В ходе дифференциального скрининга этих библиотек было выявлено два гена (названные нами scarf и collar ), специфических для постериорной регенерации. Анализ структуры идентифицированных генов показал, что последовательность гена scarf соответствует белковому продукту, относящемуся к новому семейству лектинов С-типа. Были проведены исследования экспрессии выявленных генов в интактных и регенерирующих планариях.

Полученные образцы амплифицированной ГБ и ХБ кДНК использовали для приготовления образцов кДНК драйвера и трейсера в препаративном количестве.
2.2.3. Приготовление образцов кДНК трейсера и драйвера
Образцы кДНК драйвера получали с помощью реамплификации с Т-праймером.
Для получения образцов трейсера для каждого из образцов кДНК (ГБ и ХБ) проводили реамплификацию в двух различных пробирках “А” и “Б” в присутствии Т-праймера, имеющего на 5’-конце дополнительную последовательность из 24 оснований, Outl - в случае “А” и Out2 - в случае “Б”. Это позволило ввести в структуру амплифицируемых кДНК дополнительные 24-звенные последовательности и создать на концах молекул инвертированные концевые повторы (ИКП) длиной 45 оснований. Таким образом, было получено по два образца трейсерной кДНК (с ИКП TOutl и с TOut2) для каждой из бластем. Для создания выступающих одноцепочечных 5’ концов полученные образцы трейсерной кДНК были обработаны экзо-Ш нуклеазой.
2.2.4. Вычитающая гибридизация
Для получения библиотек кДНК, обогащенных последовательностями специфически экспрессирующимися в ходе регенерации различной полярности, было проведено две вычитающей гибридизации - в одном случае трейсером служил образец ХБ к ДНК, а драйвером образец ГБ кДНК, в другом - в качестве трейсера выступала ГБ кДНК, а драйвера - ХБ кДНК.
В результате было получено два образца кДНК, один - обогащенный последовательностями, специфическими для головной бластемы (антериорная регенерация - AR, anterior regeneration), другой - для хвостовой бластемы (постериорная регенерация -PR, posterior regeneration).
2.3. Дифференциальный скрининг
Дифференциальный скрининг полученных в результате вычитающей гибридизации образцов кДНК проводили с помощью метода in vitro клонирования.