Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli

• Автор: Аветисова, Екатерина Ашотовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 86 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле
1.1.1. Инициация
1.1.2. Элонгация
1.1.3. Терминация
1.2. Традиционные представления о структуре тройного
комплекса и механизме элонгации транскрипции
1.2.1. Величина участка ДНК, закрываемого молекулой РНК-полимеразы в элонгационном комплексе
1.2.2. Величина расплетенного участка ДНК и наличие РНК-ДНК гетеродуплекса в элонгационном комплексе
1.2.3. Положение каталитического центра относительно расплетенного участка ДНК
1.3. Природа стабильности ТЭК
1.4. Механизм факторнезависимой терминации
1.4.1. Роль вторичной структуры РНК в терминации
1.4.2. Роль олиго-Т-последовательности в терминации
1.4.3. Понятие о сайтах связывания РНК-продукта
1.4.4. Реитеративный синтез РНК на промоторе.
Стабилизация инициационных комплексов,
содержащих короткие РНК
1.4.5. ДНК-РНК гетеродуплес в ТЭК

1.5. Генетические данные, свидетельствующие о роли
доменов ß- и ß’- субъединиц РНКП в элонгации
1.5.1. Нарушение элонгационных и терминационных свойств
РНКП с помощью мутаций
1.5.2. Роль «цинкового пальца» в связывании РНКП с нуклеиновым кислотами
1.5.3. Значение NADF-района для элонгации
1.6. Пространственная структура РНК-полимеразы E.coli
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Плазмиды и олигонуклеотиды
2.3. Питательные среды
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.5. Модифицирующие реагенты
2.6. Выделение плазмидной ДНК
2.7. Неденатурирующий электрофорез ДНК и выделение
фрагментов ДНК из гелей
2.8. Денатурирующий электрофорез РНК и ДНК
2.9. Денатурирующий электрофорез белков
2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.11. Выделение РНК-полимеразы
2.12. Выделение РНК-полимеразы с заменой двух остатков
цистеина на серии в положениях 71 и 73 (З’-субъединицы
2.13. Определение активности РНК-полимеразы
2.14. Иммобилизованная транскрипция на никелевом сорбенте (реакция «шагания»)
2.15. Химические способы расщепления субъединиц РНК-полимеразы
2.15.1. Частичное расщепление по остаткам метионина
2.15.2. Частичное и исчерпывающее расщепление
по остаткам цистеина
2.15.3. Исчерпывающее расщепление по остаткам
метионина
2.16. Фотоаффинная модификация РНК-полимеразы с использованием ДНК с включенным в нее
остатком 5-йодо-2' -дезоксиуридина
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение ДНК- и РНК-связывающих сайтов
в РНКП
3.1.1. Получение гомогенных ТЭК с использованием иммобилизованной РНКП
3.1.2. Система анализа основных структурных компнентов РНК-полимеразы
3.2. Структурные особенности сайтов связывания
ДНК и РНК в элонгационном комплексе
3.2.1. Определение участков субъединиц РНКП, вовлеченных

стадии элонгации были описаны еще в 70-х годах для бактерий и фагов, а недавно стали известны и для целого ряда эукариотических систем (экспрессия клеточных онкогенов и генов теплового шока, рост многих вирусов, включая HIV и аденовирусы (Bentley and Groudine, 1986; Eick and Bornkamm, 1986; Kao et al., 1987; Spencer and Groudine, 1990; Krumm et al.,1993; Rusmussen and Liss, 1993). Такая «неравная» ситуация в значительной мере может объясняться техническими трудностями, связанными с получением стабильных и гомогенных элонгационных интермедиатов.
Результаты исследований последних лет выявляют новые неожиданные свойства РНКП на поздних стадиях транскрипции. Представления о структуре элонгационного комплекса, очевидно, требуют пересмотра. Так, ключевым элементом, отвечающим за стабильность тройного комплеса, согласно классической модели, является протяженный РНК-ДНК гетеродуплекс, однако имеющиеся на данный момент экспериментальные данные, хотя и не противоречат возможности существования в определенных комплексах гибридного дуплекса, указывают на то, что ключевую роль в стабильности комплекса играют белок-нуклеиновые взаимодейтвия. Генетические данные согласуются с таким выводом и указывают на возможные районы, участвующие во взаимодействии с нуклеиновыми кислотами. Тем не менее, в отсутствие данных о трехмерной структуре РНКП с высоким разрешением, аффинная модификация и картирование мест пришивок являются ключевыми методами, которые способны дать наиболее исчерпывающую информацию о таких функциональных областях, как каталитический центр и ДНК- и РНК-связывающие домены и центры взаимодействия РНКП с различными регуляторными белковыми факторами.