Доменная организация GreA- и GreB-факторов элонгации транскрипции E. coli

• Автор: Кулиш, Дмитрий Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле
1.2. Современные представления о структуре
элонгационного комплекса
1.3. Реакция расщепления транскрипта
1.4. Бактериальные транскриптрасщепляющие факторы
1.5. Эукариотические транскриптрасщепляющие факторы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Молекулярное клонирование
2.3. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и белков
2.4. Олигонуклеотиды и определение первичных последовательностей ДНК
2.5. Получение плазмид
2.6. Выделение белков
2.7. Транскрипция in vitro
2.8. Тест на связывание гистидиновых Gre-факторов с
РНК-полимеразой
2.9. Фотохимическое сшивание РНК-транскрипта в 9А-ТЭК
2.10. Картирование участков фотохимических сшивок
2.11. Тест на активность GreA in vivo
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Методические основы транскрипционных анализов in vitro
3.2. Определение транскриптрасщепляющей активности гибридов доменов GreA и GreB в тупиковых комплексах
3.3. Сравнение связывания природных и гибридных
Gre-факторов с РНК-полимеразой
3.4. Функции доменов БгеА
3.5. Картирование района р'-субьединицы, фотохимически сшивающегося с транскриптом одновременно с Оге-факторами
3.6. Функции положительно заряженного района Ы-концевого
домена Оге-факторов
3.7. Изучение свойств гибридного белка, состоящего из РНК-полимераз-связывающего домена СгеА и транскриптсвя-зывающего домена БП-фактора
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле.
ДНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет первый этап передачи генетической информации - транскрипцию генов, в основе которой лежит синтез молекул РНК, комплементарных ДНК-матрице. Собственно синтез и простейшая регуляция транскрипции может осуществляться сравнительно простыми ферментами, такими как моносубьединичные РНК-полимеразы фагов. Однако, во всех клеточных живых организмах транскрипция осуществляется многосубьединичными РНК-полимеразами, сложность организации и функционирования которых обьясняется, видимо, чрезвычайной важностью надежности транскрипции и ее точной регуляции для жизнедеятельности организмов.
Многосубьединичные РНК-полимеразы бактерий, архебактерий и эукариот высококонсервативны, что предполагает их эволюционное родство, а также сходство механизмов действия и организации активных центров (Allison и сотр., 1985, Sweetser и сотр., 1987, Iwabe и сотр., 1991). Минимальный активный компонент всех многосубьединичных РНК-полимераз (т.н. кор-фермент) состоит из двух больших субьединиц (более 100 кДа) и одной или многих малых. Предполагается, что белковые участки, ответственные за наиболее важные и консервативные каталитические активности РНК-полимеразы, сосредоточены в больших субьединицах, в то время как малые выполняют, в основном, структурные и регуляторные функции (Sentenac, 1992). Большие субьединицы бактериальных РНК-полимераз называются |3'- и р-субьединицами. Их аналоги у эукариот называются субьединицами I и II.
Транскрипционный цикл условно разделяют на четыре основные стадии, каждая из которых, в свою очередь, состоит из многих элементарных этапов: 1) связывание РНК-полимеразы с промотором и его активация; 2) инициация цепи РНК; 3) элонгация цепи РНК; 4) терминация транскрипции.

ВатН1, в векторы рТЯС99А или рЕТ19В по сайтам N00!, затупленным фрагментом Кленова, и ВатН1. Гены, кодирующие гибриды и мутантные Сге-факторы были амплифицированы методом двухступенчатой ПЦР, согласно которому продукт первой ПЦР использовался как олигонуклеотид во второй (Орлова, 1995, КоиНс11 и сотр., 1997). Матрицы и олигонуклеотиды, необходимые для получения плазмид представлены в таблице:
Название плазмиды Матрица ПЦР-1 Праймер 1 ПЦР-1 Праймер 2 ПЦР-1 Матрица ПЦР-2 Праймер ПЦР
рОКАЫ рМ01.1 А1 АЫЕС
рОКАШ рМ01.1 А1 АЫЕС
рйКАС рМ01.1 АСЕЫ А2
рЭКАС1 рМ01.1 АСЕИ А2
рОКВИ рМ01.4 В1 ВЫЕС
рОКВС рМ01.4 ВСЕЙ В2
рОКА37А рМ01.1 А1 А37А рМ01.1 А2
рОКА52А рМ01.1 А1 А52А рМ01.1 А2
рОКАВР1_ рОКА37А А1 А52А рОКА37А А2
рОКАВРВ1 РМ01.1 А1 ВРВ1 рМ01.1 А2
рОКАВРВ2 рМ01.1 А1 ВРВ2 рМ01.1 А2
рОКАВРВ4 рйКАВРВ2 А1 ВРВ1 рОКАВРВ2 А2
рОКАВРВб рОКАВРВ4 А1 А73К рОКАВРВ4 А2
рОКАВРВ рОКАВРВб А1 ОНА рОКАВРВб А2
рОКАВРВЫз рОКАВРВб А1 ОНА рОКАВРВб А2Ыэ
рОКВ52,53А рМ01.4 В1 В5253А рМ01.4 В2Ыэ
рОКВ56,60А рМ01.4 В1 В5660А рМ01.4 В2Ыэ
рОКВВР1_ рОКВ56,60А В1 В67А рОКВ56,60А В2Ыэ
рОКВОО рОКВВР1_ В1 ВОР рОКВВР!. В2Ыэ