Денатуранты и стабилизаторы структуры белков : Анализ предпочтительной сольватации

• Автор: Ковригин, Евгений Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 127 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ б
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Явление предпочтительной сольватации как основа механизмов стабилизации/дестабилизации структуры белков в водных растворах с высоким содержанием неводной компоненты
2.1.1 Предыстория вопроса
2.1.2 Термодинамический анализ влияния состава раствора на
равновесия (денатурационное, растворение и олигомеризация белков)
2.1.2.1 Основные величины
2.1.2.2 Связь между предпочтительными взаимодействиями и молекулярными контактами
2.1.3 Экспериментальные наблюдения
2.1.3.1 Выделение вкладов воды и добавки в предпочтительную сольватацию
2.1.3.2 Предпочтительная гидратация и стабилизация белков
2.1.3.3 Два основных типа предпочтительной гидратации
2.1.3.3.1 Первый тип: неспецифическое взаимодействие
2.1.3.3.2 Второй тип: специфическое взаимодействие
2.2 Стабилизация и денатурация: калориметрия и нетермодинамические
методы
2.2.1 Температурная зависимость стабильности белков в смешанных растворителях
2.2.1.1 Влияние малополярных органических добавок на термостабильность, энтальпию и скачок теплоемкости при денатурации. Предсказание температур схождения энтропии и энтальпии
2.2.1.2 Влияние стабилизаторов на термодинамические параметры
денатурации. Скачок теплоемкости. Температуры схождения энтальпий
2.2.1.3 Комбинированное использование денатурационных данных и
равновесного диализа
2.2.1.4 Стабилизация нативного свернутого состояния белка не обязательно требует от растворителя способности формировать упорядоченные кластеры
вокруг гидрофобных групп
2.2.1.5 Гипотетический эффект стабилизации белков при пониженных
температурах малыми концентрациями денатурантов

2.2.2 Структурные исследования белков в смешанных средах: возникновение ненативных лабильных конформаций белковой цепи
2.2.3 Белки в средах с низким содержанием воды. Ферментативная активность в смешанных средах
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Реактивы
3.2 Приготовление буферных растворов с высоким содержанием
неводной компоненты
3.2.1 Буферные растворы
3.2.2 Измерение реального pH водно-органической смеси
3.2:3 Контроль состава раствора (рефрактометрия и гравиметрия)
3.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка в водноорганической смеси
3.4 Контроль мономолекулярности нативного состояния белка
3.5 Сканирующая микрокалориметрия
3-5.1 Оборудовать и подготовка препаратов
3-5.2 Эксперименталъые проблемы, вызванные высоким содержанием неводной компоненты
3-5-3 Первичная обработка термограмм тепловой денатурации
3-5.4 Обработка результатов экспериментов методом наименьших квадратов
3.6 Методы расчета основных термодинамических функций
стабилизации нативной структуры лизоцима
3.6.1 Выбор уравнений для подгонки экспериментальных значений температуры и энтальпии 61 3-6.2 Аналитические уравнения для энтропии и свободной энергии стабилизации структуры, поглощения протонов и скачка
сольватации при переходе из нативного в денатурированное
состояние
3.7 Измерение давления насыщенного пара над водными растворами органических веществ
3.7.1 Аппарат для измерения давления паров
3-7.2 Вычисление парциального давления водяного пара
3.7.3 Вычисление коэффициентов активности

3.7.4 Температурная зависимость коэффициентов активности
3.7.5 Измерения парциальной удельной энтальпии воды, в растворах полиспиртов 68 3.8 Расчет скачка предпочтительной сольватации при температурах
тепловой денатурации на основе денатурационных данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Исследование стабилизирующего влияния полиспиртов
4.1.1 Исследование активности воды в растворах полиспиртов
4.1.2 Расчет скачка предпочупителъной сольватации при тепловой денатурации лизоцима в растворах полиспиртов
4.2 Исследование дестабилизирующего эффекта органических неионных денатурантов
4.2.1 Исследование тепловой денатурации лизоцима методом сканирующей калориметрии
4.2.2 Расчет активности компонентов в растворах ряда органических неионных соединений
4.2.3 Расчет изменения предпочтительной сольватации
4.3 Исследование тепловой денатурации лизоцима в растворах
ацетонитрила методом сканирующей калориметрии
4.3.1 Контроль кинетики денатурагщи
4.3.2 Результаты сканирующей калориметрии
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5.1 Термодинамика влияния стабилизирущих добавок на лизоцим
5.2 Термодинамика влияния денатурирующих добавок на лизоцим
5.2.1 Корелляция скачка предпочтительной сольватации при денатурации лизоцима в водных растворах ряда негомологичных органических соединений с их активностью
5.2.2 Различие зависимостей денатурационного скачка сольватации лизоцима в растворах ДМСО и других рассмотренных соединений
5.3 Температурная зависимость термодинамических параметров
стабилизации лизоцима в смешанном растворителе
5.3.1 Энтальпия разворачивания
5.3.2 Термодинамическая стабильность лизоцима в водных растворах
МеСИ

цифры будут действительно равновесными функциями состояния , то можно будет замкнуть термодинамический цикл.
Для выполнения такой задачи нужно измерить предпочтительное взаимодействие нативного и денатурированного белка при одном и том же составе раствора и температуре. Поскольку невозможно получить равновесным образом нативный и денатурированный белок в одних и тех же условиях, авторы предположили, что для этого можно использовать разный pH. Были поставлены эксперименты (20° С при обоих pH), которые показали независимость предпочтительной сольватации нативного белка от pH: при обоих pH белок был одинаковой степени предпочтительно гидратирован. При 48°С гидратация нативного белка (pH 5.5) оказалась меньше и сильно падала с ростом концентрации сорбита, меняя знак при 20%. Денатурированный белок (pH 2.0) при той же температуре сохранял положительные значения предпочтительной гидратации, хотя и меньшие, чем нативный белок при 20°С. Эти результаты означают, что несмотря на предпочтительное исключение, сорбит взаимодействует с РНКазой А (слабо связывается), причем при повышении температуры связывание сорбита усиливается.
Значения предпочтительной сольватации, полученные в экспериментах, анализируются авторами уравнением (10). Величины В1 и В3 интерпретируются как усредненные по времени количества воды и сорбита (весовые), находящиеся в контакте с белковой поверхностью. Заметим, что если эту формулу выводить из модели Шеллмана (фсЬеНтап, 1990), то эти величины есть числа необмениваемых участков связывания для того и другого компонента, где вода не обменивается на сорбитол и наоборот; это предполагает наличие пустых участков, которые при отсутствии 3-го компонента вообще не заняты. Однако, Шеллман, рассматривая интерпретацию Тимашеффа, не критикует её и не признает её фактически идентичной модели Эйзенберга, хотя последнюю как раз считает грубой и неадекватной (подробнее об этой дискуссии см. БсйеПтап, 1990). Чтобы выработать более детальное молекулярное описание происходящих явлений, авторы вводят предположение, что размер гидратной оболочки белка не меняется при изменении концентрации сорбитола. Тогда число В! для количества воды в гидратной сфере белка можно считать постоянным (его берут из литературы), и тогда по формуле (10) легко вычисляется В3. Основным выводом авторов о причинах стабилизации белка сорбитолом является следующий: гидратация