Идентификация генов хромосомы 19 человека вблизи LTR эндогенного ретровируса HFRV-K

• Автор: Хиль, Павел Павлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: ИХ РОЛЬ В
ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ГЕНОМА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Введение
Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности в геноме
человека
Роль эндогенных ретровирусов в функционировании генома человека
Заключение
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение
Стратегия, использованная для идентификации генов влокусах хромосомы
человека содержащих LTR эндогенного ретровируса семейства HERV-K
кДНК селекция на космиды, содержащие LTR HERV-K
Анализ обогащенных кДНК библиотек
Выделение индивидуальных фрагментов кДНК, специфичных к определенным
локусам хромосомы 19 человека и их последующее секвенирование
Точное картирование на хромосоме 19 человека идентифицированных генов и
определение их взаиморасположения с LTR HERV-K
Определение тканеспецифичности экспрессии идентифицированных
потенциальных генов
Высокоразрешающее взаимное картирование кодирующих областей гена ZNF91 и
LTR HERV-K
Идентификация и характеристика вариантов транскриптов генарЗ
регуляторной субъединицы 26S протеасомы
Характеристика потенциального гена со специфической экспрессией в тканях
мозга человека
Сравнительный структурный анализ индивидуальных LTR
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Оборудование и расходные материалы
Реактивы и ферменты
Штаммы, культуры, плазмиды
Космидные библиотеки
PCR-амплификация
кДНК селекция
Клонирование продуктов кДНК селекции
In Vitro клонирование
Southern- и Northern-блот гибридизация
Выделение РНК
RT-PCR
RACE
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Эндогенные ретровирусы человека (Human Endogenous Retroviruses, HERV) представляют собой стабильно наследуемые геномные последовательности, сходные по структуре с геномами ретровирусов. Полагают, что они являются потомками экзогенных ретровирусов, внедрившихся в геном предшественников человека. В геноме человека обнаружено более десяти семейств таких последовательностей, как сохранивших в разной степени измененные остатки генов ретро-вирусов, так и существующих в виде отдельных длинных концевых повторов (Long Terminal Repeals, LTR). Они могут также рассматриваться как мобильные генетические элементы, способные вызывать многочисленные мутации в геномах хозяев. По сделанным оценкам, по меньшей мере 1 % генома человека состоит из последовательностей HERV. Описано несколько типов HERV отличающихся друг от друга, в частности типом тРНК осуществляющей инициацию обратной транскрипции. В соответствии с этим признаком HERV классифицируют как HERV-E (инициатор — тРНК глутаминовой кислоты), HERV-H (гистидиновая тРНК), HERV-К (лизиновая тРНК) и т.д.
Биологическая роль и патогенный потенциал HERV пока неясны. Однако существует ряд данных об участии HERV в регуляции экспрессии генов, в опухо-леобразовании, предотвращении заражения похожими экзогенными ретровирусами, иммуносупрессии, а также в качестве патогенных агентов при некоторых аутоиммунных заболеваниях. Предполагается их связь с такими заболеваниями, как диабет и рассеянный склероз.
LTR включают в себя множество элементов, регулирующих транскрипцию — промоторов, энхансеров, элементов гормональной регуляции, сигналов поли-аденилирования — вследствие чего могут вызывать существенные изменения в картине экспрессии близлежащих генов человека. Обнаружение LTR-pery-лируемых генов является, таким образом, актуальным направлением в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, в исследовании полиморфизма и эволюции, как отдельных генов человека, так и генома в целом. Задачей данной работы был структурный анализ последовательностей LTR HERV-К и идентификация кандидатных генов вблизи отдельных LTR на хромосоме 19 человека. В качестве объекта исследования был выбран HERV-К, поскольку именно это семейство эндогенных ретровирусов человека в наибольшей степени сохранило функциональный потенциал.

ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: ИХ РОЛЬ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ГЕНОМА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
Введение.
Процессам обратной транскрипции и ретротранспозиции приписывают одну из главенствующих ролей в эволюции (1 ). В геноме человека существует ряд типов последовательностей, использующих (или использовавших) обратную транскрипцию в своем жизненном цикле, одним из которых и являются эндогенные ретровирусы. Эндогенные ретровирусы являются потомками экзогенных ретро-вирусов, которые интегрировали в геном и после этого наследовались как его составная часть. Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности составляют значительную часть генома позвоночных и человека в частности (для обзора см. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Недавно появились сообщения об обнаружении ретровирусов и у беспозвоночных (12, 13). По различным оценкам, подобные последовательности составляют не менее 1% от общей ДНК человека (3, 4). Естественно, что столь большой объем вирусной информации, находящейся в геноме человека оказывает определенное влияние на функционирование генома. В данной работе мы попытаемся описать разнообразие эндогенных ретровирусных элементов в геноме человека и их возможное влияние на структуру и функционирование генома и человеческого организма.
Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности в геноме человека.
В геноме человека обнаружено значительное количество различных семейств эндогенных ретровирусов (3, 4, 5, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Среди них представлены как однокопийные (14, 15, 16), так и многокопийные эндогенные ретровирусы (17,18,19,20, 21, 22,23,24, 25,26, 27). Следует отметить, что количество копий для представителей каждого из семейств вопрос достаточно тонкий. По крайней мере, в одном случае имеются сведения о том, что описанный ранее как одноко-пийный ретровирус был в дальнейшем охарактеризован как низкокопийный (28). Отличительной особенностью эндогенных ретровирусов является их большое разнообразие. В то время как в геноме человека содержится относительно немного различных семейств коротких диспергированных повторов (SINE) (Alu,

42/1

KRAB

AGTGGAAATGCCTGGACCCTGCTCAGAGGACTCTATACAGAGACGTGATGCTGGAGAATTATAGGAACCTGGTCTCCCTGGGTGAGGATA І І І І І І II І ! І III І І І І ! І 1 III II І І II І І І І І І І І І II І І І II І І II І І І І І І І І І І І І І І І І І І І AGTGGAAATGCCTGGACCCTGacCAGcaGAaTTTgTAt AGAGAtGTGATGtTGGAGAAcTAcAGGAACCTGGTCTCCCTGG "286
ZNF141
AGTGGAAATcCCTGGACCCTGtGCAGAaaGCTtTcrTACtGGGAtGTGATGtTGGAGAAcTAcAGGAACCTGGTCTtCCTGGIGTaaGGATA N94749
p42-for ►
42/1 ACTTCCCTCCAGAAGTGGGGATGTGCCCTTGTGGATCTTTGTATTTTCTCTTGTTTCT—CTTGGGAGTTGCATCCTTGCTTGACTAAAA 178 III І І І І І І І І І І І І І І І І І І І I II І І І І І І I II І І І І І III І І I 1-І І І І І І І І III II І І І І І I
313 AtTTtgCTCtAGAAGTtAAGATcTGCCCTcGTGtATtTTTGTATTTTCTCTgtTgTCTttCTTGGGAGcccttcCaTTgtTTGACTgAgA N94749
p42-rev
42/1 TGGAAGCTGTATTGATTTTGAAATGAAAAGCTTCATGATGTAGCATCTGGACTTTCACTGTCCCCTTTGTTTAGATGTTCTGCGTTCTTC 2 68 І I II I II I II І І І І І I II І І І І І I II I II!
403 ctGAAGCtGTgTTGAcTcacAAATaAAAAGCTTCATaATG N94749
42/1 ATGATACCTCAATGTGGGTTCCAGAACTAAAGTAGGCATAAAACCTTATGGCAAGCTGGGCATGGTGGTTCATGCCTGTCGTCCCAGAAC
Il І І І і И І І І I И І І І І І I N І І І ! Il
AluSq GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCAC
42/1 CTTGGGGGACTGAGGTGTGTGGATCACTTCAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAÀCCCTGTCTCTAC'TAGGGGTA 448 I II І І І I lll! І І І І І I И І І І І І І І І І І I II І! і І І I II І І І І I 1 І І І І I И І І І І I II I II І І І I II І I И I II
Alu tttgggaggccgaggcgggtggatoacctgaggtcaggagttcgagaccagcctggccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaata
42/1 CAAAAATTAGCCGGACGTCATGGTGCACACCTGCAATCCCAGCTCCTAGAAAGGCTGAGG-AGAGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCCA 538 1111 II 11111111 I и и І І I II 11 II 111 [ 1111 і1 І 11 II 111 II 11 1111 II 1111 II 1111 111111
Alu CAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAG-GAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGG
42/1 AGGTTGCAGTGA 549 11111111 II 11 Alu AGGTTGCAGTGA
Рисунок 6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей клона 42/1.фрагмента кДНК гена ZNF141, AJu-повтора и EST N94749, Последовательность, кодирующая KRAB-A домен обведена рамкой. Стрелками показано положение праймеров. Координаты указаны рядом с соответствующими последовательностями.