Исследование молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка у растений

• Автор: Искаков, Булат Кудайбергенович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1997
• Место защиты: Алматы
• Количество страниц: 55 с.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. Изучение механизмов и регуляции биоситеза белка - одна из главных задач молекулярной биологии. Контроль экспрессии генов на уровне трансляции матричных (м)РНК у прокариот известен уже на протяжении многих лет и лишь относигельно недавно был надежно продемонстрирован на молекулярном уровне для эукариотических организмов. В настоящее время уже хорошо описано несколько примеров трансляционного контроля экспрессии генов в эукариотических клетках: мРНК гена GCN4 у дрожжей; мРНК белков теплового шока 22 кДа и 70 кДа у Drosophila; мРНК ферритина и трансферринового рецептора, а также многие мРНК вирусов животных и растений. Изучение этих примеров показало, что первичная структура мРНК заключает в себе не только информацию о кодируемом белке, но и полный набор сведений о самой мРНК как о функционирующей молекуле. Информация второго рода расшифровывается труднее и далеко не все элементы структуры, существенные для функционирования мРНК, выявлены в настоящее время. Даже в тех случаях, когда они известны, чаще всего не ясно, каким компонентам транслирующего аппарата адресована эта информация и как она распознается и реализуется.
Многочисленные работы последних лет показывают, что важную роль в модуляции эффективности трансляции мРНК играют их 5'-нетранслируемые последовательности (5-НТП). Основными структурными чертами 5’-НТП, влияющими на эффективность трансляции эукариотических мРНК, являются: наличие и стабильность вторичной структуры; присутствие и взаимное «*''ттгчтт0жение “ложных” инициирующих кодонов и соответствующих им .кытых рамок трансляции; определенное нуклеотидное окружение вблизи .южных” и “истинных” инициирующих кодонов; доступность 5’-концевой чел-структуры мРНК.
•Однако, несмотря на очевидную значимость, ни одна из этих черт, ни даже I * озокупность не могут охватить всего многообразия факторов, регулирующих ’ : ансдяцию мРНК в эукариотических клетках. Большая роль в этом отводится мому аппарату трансляции. Из 12 белковых факторов инициации трансляции :!улярот (elF) некоторые (eIF4E, -4F, -4А) могут связываться с 5'-концевой : структурой и участвовать в АТФ-зависимом расплетании вторичной туктуры 5’-НТП мРНК. Активность факторов трансляции (elF2, -4В, -4Е,

4F, eEFl, eEF2) может регулироваться посредством ковалентных модификаций. Кроме того, в последнее время появляются работы по изучению низкомолекулярных РНК и вторичных продуктов метаболизма, которые, по-видимому, могут участвовать в регуляции процесса трансляции. Следует помнить также, что мРНК в эукариотических клетках находятся в комплексе со специфическими белками, образуя рибонуклеопротеидные комплексы -информосомы, и что белки информосом также могут регулировать эффективность трансляции мРНК.
Таким образом, эукариотические мРНК транслируются с различными эффективностями как in vivo, так и in vitro. Молекулярные механизмы такой неравной трансляции еше не выяснены, однако экспериментальные данные свидетельствуют, что в их основе лежит взаимодействие мРНК с компонентами белок-синтезируюшего аппарата. Влияние cis- и trans-действующих регуляторных факторов на эффективность трансляции мРНК у растений изучено гораздо слабее, чем у животных.
Хотя основные пути биогенеза мРНК и этапы их трансляции в клетках животных и растений сходны, исследования последних лет свидетельствуют, что между ними имеется существенная разница в механизмах регуляции биосинтеза белка. Как показано в работах нескольких групп исследователей, многие белковые факторы трансляции растений отличаются от своих аналогов из клеток животных по структуре и не являются взаимозаменяемыми в гетерологичных бесклеточных системах синтеза белка. Нами впервые показано, что в растительных системах, по-видимому, отсутствует регуляция синтеза белка посредством фосфоршшрования факторов инициации eIF2 и элонгации. eEF2, надежно установленная и хорошо изученная для клеток животных.
Все эти факты свидетельствуют, что молекулярные механизмы и регуляция биосинтеза белка у растений требуют самостоятельного детального изучения. Знание этих механизмов позволит направленно создавать растения с качественно новыми хозяйственно-ценными признаками, открывает возможность для борьбы с вирусными заболеваниями.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка в клетках высших растений с целью поиска механизмов трансляционного контроля, характерных для клеток растений, а также с целью сравнения их с таковыми у клеток животных и выявления возможных различий между ними.

Анализ РНК 45S частиц в градиенте сахарозы (рис. 14Б) показал, что в препарате не содержится 25S рРНК, а присутствуют 17S рРНК, гетерогенная по размеру РНК (6-16S) и небольшое количество низкомолекулярных РНК (4-6S). Следует отметить, что 4-6S РНК 45S частиц обладает способностью ацилироваться [35 S] метионином в присутствии препарата аминоацил-тРНК синтетаз из E. coli, что свидетельствует о наличии в 45S PHП-частицах инициаторной тРНКМет. Около 20% радиоактивности приходится на новосинтезированную 17S рРНК, однако большая часть быстрометящейся РНК распределяется гетерогенно в интервале 6- 16S, что характерно для мРНК. Анализ РНК 45S частиц электрофорезом в 2-15% градиентном ПАА геле (рис. 14В) подтвердил результаты седиментационного анализа и выявил в низкомолекулярной зоне характерный набор РНК. Помимо высокомолекулярных РНК в препарате содержится небольшое количество тРНК, а также ряд дискретных малых РНК, из которых наиболее представлена РНК (5,3S) длиной около 135 нуклеотидов (подробнее об изучении свойств 5,3S РНК будет изложено в следующем разделе работы).
Другим важным критерием матричной природы РНК является ее способность направлять синтез белка in vitro. Для измерения матричной активности из сахарозных градиентов (рис. 14) вычленяли по три зоны:
I - 15-18S; II - 10-15S; Ш - 6-10S, и содержащиеся в них PH К транслировали in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Результаты, представленные на рисунках 14А и 14Б в виде гистограмм, свидетельствуют, что быстрометящиеся новоеинтезированные РНК полирибосом и 45S частиц содержат большую пропорцию мРНК.
Очевидно, что идентификация новосинтезированных РНК как мРНК справедлива лишь при использовании очень коротких периодов инкубации зародышей пшеницы с радиоактивным предшественником (не более 30 мин). Увеличение продолжительности инкубации сопровождается активным включением радиоактивной метки в рибосомные, транспортные и другие виды РНК.
Сохранялась возможность того, что наличие мРНК в 45S-30ne сахарозного градиента является результатом наложения гетерогенно седиментирующих информосом. Чтобы проверить эту возможность, препарат рибосомной фракции разделяли в сахарозном градиенте, вычленяли четыре зоны: I - 80-90S; II - 60-70S; III - 40-50S; IV - 10-25S, и экстрагированные из них РНК транслировали in vitro. Результаты, представленные на рисунке 15,