Теоретический анализ пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса ризопуспепсина

• Автор: Кашпаров, Илья Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. РАЗВИТИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ
АСПАРТАТНЫХ ПРОТЕИНАЗ
Часть 1. Концепции ферментативного катализа
Часть 2. Химия протеолиза
Часть 3. Рентгеноструктурный анализ аспартатных протеиназ
Часть 4. Современные представления о механизме каталитического акта
аспартатных протеиназ
ГЛАВА II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Часть 1. Конформационная и электронная задачи катализа
Часть 2. Постановка задачи и план исследования
Часть 3. Метод теоретического конформационного анализа.
Потенциальные функции и эмпирические параметры
ГЛАВА III. СТРУКТУРНАЯ МОДЕЛЬ СУБСТРАТ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО
УЧАСТКА РИЗОПУСПЕПСИНА И АПРОБАЦИЯ РАСЧЕТНОГО МЕТОДА
Часть 1. Объекты исследования
Часть 2. Структурная модель активного центра
Часть 3. Комплекс ризопуспепсина с пептидным ингибитором
ГЛАВА IV. НЕВАЛЕНТНЫЕ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ
РИЗОПУСПЕПСИНА
Часть 1. Фермент-субстратный комплекс михаэлиса
Часть 2. Комплекс ризопуспепсина с промежуточным тетраэдрическим
соединением
ГЛАВА V. СХЕМА КАТАЛИТИЧЕСКОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ
РИЗОПУСПЕПСИНА
ВЫВОДЫ
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ.
Аспартатные протеиназы относятся к классу широко распространенных эндопептидаз, обнаруживаемых практически во всех таксономических группах животных, растений, микроорганизмов и ретровирусах. Их медико-биологическая значимость определяется участием в контроле ряда процессов жизнедеятельности человека, связанных с пищеварением (пепсин), регуляцией кровяного давления (ренин), метаболизме белков и процессинге гормонов (катепсины И,Е) и некоторых других. Установление роли аспартатных протеиназ в созревании частиц ретровирусов, вызывающих такие заболевания как СПИД, некоторых видов лейкозов, сарком и опухолей молочных желез определило их привлекательность в качестве мишеней для антивирусной терапии. В результате многих исследований стало очевидным, что целенаправленный поиск эффективных лекарственных средств невозможен без знания деталей каталитического механизма действия этих ферментов и понимания структурных основ их специфичности.
В настоящее время представление о механизме каталитического действия аспартатных протеиназ формируется преимущественно на основе данных рентгеноструктурного анализа. Однако, несмотря на чрезвычайную информативность этого метода, он имеет ряд специфических ограничений. Во-первых, получаемая с его помощью информация касается статического состояния фермента и, следовательно, прямо не отвечает на вопрос о динамических конформационных характеристиках трехмерных структур. Во-вторых, этот метод, за редким исключением, позволяет расшифровывать структуры комплексов ферментов лишь с ингибиторами, но не с субстратами. Получаемые данные о многих сериях ингибиторных комплексов демонстрируют отличия этих ингибиторов по своему химическому и пространственному строению как от истинного субстрата, так и друг от друга

зная продуктивного расположения субстрата в активном центре, а также актуальных для катализа фермент-субстратных взаимодействий и обусловленных ими кон-формационных перестроек, — трудно составить достаточно полное и объективное представление о специфике каталитической реакции.
Поэтому для решения задачи о каталитическом механизме действия аспартатных протеиназ полезно привлечение методов теоретического конформаци-онного анализа и компьютерного моделирования. Преимущество теоретического подхода заключается в его принципиальной возможности исследовать любые конформационные состояния и количественно оценивать основные факторы, формирующие наиболее вероятные пространственные формы.
Настоящая работа посвящена теоретическому анализу пространственной структуры невалентного фермент-субстратного комплекса аспартатной протеиназы ризопуспепсина на стадиях комплекса Михаэлиса и промежуточного тетраэдрического соединения. Основные задачи данного исследования состояли в
а) выборе структурной модели субстрат-связывающего участка молекулы фермента и апробации расчетного метода; б) предсказании энергетически предпочтительных конформационных состояний субстрата в активном центре ризопуспепсина на стадии образования невалентного комплекса и их последующем анализе с целью оценки продуктивности расположения гидролизуемой пептидной группы относительно каталитически активных групп фермента; в) моделировании структуры тетраэдрического промежуточного соединения в комплексе с ризопуспепсином и ее анализе с целью установления факторов, существенных для протекания катализа; г) создании рабочей модели каталитического механизма ризопуспепсина для ее последующего теоретического анализа квантовохимическими методами.

кислород расщепляемой связи, двух групп NH остатков Gly78 и Asp79 (нумерация ризопуспепсина), которые входят в последовательность нависающего над субстратом ß-структурного фрагмента.
Действия нуклеофила и электрофила в согласии с предыдущими моделями механизма функционирования аспартатных протеиназ приводят к образованию неустойчивого промежуточного соединения, распадающегося на H2N- и -СООН продукты реакции. И в этом случае, как и в рассмотренном выше, автор [107] следует концепции напряжения, то есть постулирует необходимость трансформации энергии фермент-субстратных невалентных взаимодействий в энергию деформации пептидной связи, облегчающей ее гидролиз.
Модель механизма действия аспартатных протеиназ, предложенная М. Яскольски и сотр. [108], основана на трехмерной структуре ретровирусной протеиназы HIV-1. В качестве нуклеофила и здесь выбирается центральная молекула воды, расположенная на равных расстояниях между боковыми цепями остатков Asp25 и Aspl25 (рис. 7). Учитывая симметрию фермента, авторы поместили одну из гидроксильных групп Н2О вдоль оси второго порядка таким образом, что она может образовывать бифуркационную водородную связь с внутренними карбоксильными атомами кислорода остатков аспарагиновой кислоты. Вторая гидроксильная группа Н2О направлена к внешнему кислороду О8 карбоксила Asp25. Кислый протон неионизированной боковой цепи Aspl25 образует водородную связь с атомом кислорода молекулы воды. Таким образом, согласно динамической модели Яскольски и сотрудников [108], нативная HIV-1 протеиназа в равновесном состоянии обладает симметричной системой из пяти атомов кислорода, в поле которых мигрируют соответствующим образом атомы водорода.