+
Действующая цена700 499 руб.
Товаров:
На сумму:

Электронная библиотека диссертаций

Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО

Расширенный поиск

Исследование ранних стадий слияния биологических и искусственных мембран, индуцированного белком вируса гриппа гемагглютинином

  • Автор:

    Самсонов, Андрей Владимирович

  • Шифр специальности:

    03.00.02

  • Научная степень:

    Кандидатская

  • Год защиты:

    1999

  • Место защиты:

    Москва

  • Количество страниц:

    106 с.

  • Стоимость:

    700 р.

    499 руб.

до окончания действия скидки
00
00
00
00
+
Наш сайт выгодно отличается тем что при покупке, кроме PDF версии Вы в подарок получаете работу преобразованную в WORD - документ и это предоставляет качественно другие возможности при работе с документом
Страницы оглавления работы

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
I. Введение
П.Слияние биологических мембран
III. Экспериментальные модельные системы для изучения механизмов слияния мембран
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I. Клеточные линии
II. Подготовка клеток к эксперименту
III. Выделение, очистка и окраска вируса гриппа А штамма Ja-
рап/305/57

V. Флуоресцентная видеомикроскопия
VI. Метод ёмкостного контроля за стадиями слияния БЛМ
VII. Измерение электрической проводимости поры слияния
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Исследование перераспределения гидрофобных зондов на ранних стадиях слияния 2-х плоских БЛМ
II. Слияние ГА-экспрессирующих клеток с эритроцитами и БЛМ
III. Влияние липидного состава мембраны-мишени на картину слияния НАЬ2 клеток с БЛМ
IV. Предпробойные флуктуации проводимости БЛМ, индуцированные электрическим полем, качественно схожи с проводимостью поры слияния
V. Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение
Проблема слияния биологических мембран всегда привлекала к себе внимание, что обусловлено универсальностью явления: слияние лежит в основе целого ряда физиологических процессов, таких как экзоцитоз, секреция, образование вторичных лизосом, проникновение в клетку оболочечных вирусов. Известно, что все живые организмы (исключая вирусы) состоят из клеток, содержимое которых отделено от окружающей среды мембраной. Основой любой биологической мембраны является липидный бислой - бимолекулярная пленка, состоящая из двух монослоев амфифильных молекул, гидрофобные “хвосты” которых находятся внутри бислоя, а полярные гидрофильные части контактируют с окружающим раствором. Экспозиция гидрофобной области бислоя в полярную среду энергетически невыгодна, следствием чего является замкнутость бислойной поверхности, отсутствие краев. Гидрофобная область бислоя является препятствием для проникновения через мембрану гидрофильных молекул, что и лежит в основе главной физиологической функции биомембран -барьерной [1, 2]. Цитоплазматическая мембрана отделяет внутренний объем клетки от внешней среды, а внутренние мембраны разделяют его на множество компартментов, что позволяет создавать наиболее выгодные условия для биохимических реакций (оптимальный pH, необходимый набор ферментов и реагирующих веществ). Однако непременным условием жизнедеятельности любого организма является как внутриклеточный обмен веществом и энергией, так и обмен с внешней средой. Частично эту функцию в клетке выполняют мембранные белки, осуществляющие селективный транспорт через мембрану небольших гидрофильных молекул (неорганических ионов, сахаров, аминокислот и т.д. ), но для транспорта крупных молекул и для их массовой доставки (секреция, экзоцитоз) в клетке работает иной механизм: целенаправленная транспортировка веществ в замкнутых мембранных везикулах и слияние их с внутренними компартментами клетки или с цитоплазматической мембраной [3, 4]. В основе этого процесса лежит способность биологических мембран сли-

ваться друг с другом. Этот процесс в клетке контролируется специальными белками, задача которых осуществить прочную адсорбцию везикулы в сайте слияния и объединить ее внутренний объем с объемом компартмен-та-мишени [5, 6, 7, 8].
На модельной системе 2-х бислойных липидных мембран (БЛМ) удалось показать, что процесс слияния двух искусственных мембран проходит через следующие последовательные стадии: 1) плоскопараллельный контакт, когда контактирующие мембраны (КМ) находятся на равновесном расстоянии друг от друга, 2) монослойное слияние (МС) - образование одного общего бислоя в области контакта двух мембран и формирование триламинарной структуры (ТС), 3) полное слияние (ПС) - объединение водных объемов и мембран.
В случае слияния биологических мембран, индуцированного специальными белками слияния (БС), не удалось прямыми экспериментальными методами зафиксировать возникновение ТС, предшествующее ПС. Примером является инфицирование клетки оболочечным вирионом, когда проникновение вирусного генома в клетку происходит в результате ПС мембран клетки и вируса и опосредовано вирусными БС, встроенными в липидную оболочку вируса. До сих пор не известно, какую роль при этом играют БС. Возможно, они лишь сближают липидные матриксы, и дальше процесс идет спонтанно, или же являются важными компонентами поры слияния и влияют на ее эволюцию? Так как весь цикл развития вируса происходит внутри клетки, лечение вирусных заболеваний лекарственными препаратами малоэффективно. Очевидно, что для предотвращения заражения вирусом наиболее действенной мерой было бы не дать вирусу слиться с клеткой. Для успешного решения этой задачи необходимо выяснить все стадии этого процесса. Знание механизмов слияния поможет также решить задачу прямой доставки внутрь клетки лекарств и генов в липосомах и ретровирусных векторах [9, 10, 11, 12, 13]. Вирусные БС индуцируют ПС мембран, однако детальный механизм этого явления остается неясным. Известно, что искусственные бислои, например БЛМ, могут сливаться спонтанно, если добиться достаточно плотного их кон-

трофизиологического метода с флуоресцентным позволяет синхронно следить за объединением липидных матриксов и водных объемов [74, 76]. Клетки, экспрессирующие БС, сливаются и с искусственными мембранами, например с липосомами и плоскими БЛМ. Так, для исследования слияния Меликяном была предложена модельная система плоская БЛМ/клетка [138]. Мембраной-мишенью в этом случае является плоская горизонтальная БЛМ, липидный состав которой можно варьировать. На этих модельных системах было показано, как индуцируют слияние БС в зависимости от их плотности экспрессии на клеточной мембране, условий ферментативной обработки БС, температуры среды и т.д. Так, для слияния пары фибробласт МН ЗТЗ НАЬ2 (клеточной линии стабильно экспрессирующей ГА Н2 типа вируса гриппа штамма 1арап/305/57) и эритроцит человека методами электрофизиологии и флуоресцентной видеомикроскопии было показано, что снижение плотности ГА на клеточной мембране качественно меняет картину слияния. Пора слияния, соединяющая клетку и эритроцит не образуется, и ГА индуцирует образование липидной непрерывности между КМ, т.е. смешение липидов. Эта ситуация аналогична стадии полуслияния (образования ТС) в случае искусственных бислоев. Эти данные подтверждают, по мнению авторов, гипотезу, по которой для образования поры слияния требуется сборка комплекса тримеров ГА -“розетки слияния” [17]. При недостаточной же плотности белка, “розетка” не успевает собраться полностью, и ГА катализирует лишь полуслияние мембран, без образования поры. Полуслияние ранее было получено с мутантной формой ГА, у которого трансмембранный домен (ТД) белка был заменен на липидный “якорь” - молекулу гликозилфосфатидилинози-тола (ГФИ-ГАф ГФИ-ГА индуцировал в большинстве случаев лишь липидную связность, но не полное слияние. Это было продемонстрировано на системе клетка/эритроцит [139] и при слиянии ГФИ-ГА-экспрессирующих клеток с плоским бислоем [140]. Была выдвинута гипотеза, согласно которой роль ТД заключается в дестабилизации ТС в начале ее роста и образовании в ней липидной поры слияния. Однако, замена белкового ТД на липидный может существенно снижать и стабильность

Рекомендуемые диссертации данного раздела

Время генерации: 0.142, запросов: 967