Разрывы ДНК, их репарация и гибель покоящихся лимфоцитов крови человека

• Автор: Тронов, Виктор Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 175 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1. Актуальность проблемы
2. Цель и задачи исследования
3. Научная новизна полученных результатов
4. Научно-практическая значимость
5. Положения, выносимые на защиту
6. Апробация работы
6. Список публикаций по теме диссертации
Глава 1 ДНК-КОМЕТЫ КАК МАРКЕР КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ
1.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
1.1.1 Клеточная гибель
1.1.2 Методы регистрации апоптоза
1.1.3 Повреждение ДНК в индивидуальных клетках.
Метод ДНК-комёт
1.2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.2.1. Материалы и методы
1.2.2. Результаты и обсуждение
1.2.2.1 Классификация ДНК-комет
1.2.2.2 Связь mt с количеством разрывов и фазой
апоптоза (калибровка метода)
1.2.2.3 Корреляция метода ДНК-комет с
морфологическими изменениями клеток в процессе гибели
1.2.2.4 Поврежденность ДНК и спонтанный апоптоз
лимфоцитов больных системной красной волчанкой
1.2.2.5 Оценка повреждений ДНК в ЛКЧ при
фракционированном облучении in vivo
1.2.2.6 Заключение
Глава 2 НЕКРОЗ И АПОПТОЗ В РАДИАЦИОННОЙ ГИБЕЛИ
ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ
2.1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
2.1.1 Радиочувствительность лимфоцитов in vitro
2.1.2 Механизмы радиационного апоптоза
лимфоцитов
2.2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1 Материалы и методы
2.2.2 Результаты и обсуждение
2.2.2.1 Зависимость mt от количества двунитевых
разрывов
2.2.2.2 Нейтральные кометы, формируемые
некротическими клетками
2.2.2.3 ДНК-кометы в процессе радиационной гибели
лимфоцитов
.2.2.2.4 Заключение
Глава 3 ДВУНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ ДНК И АПОПТОЗ
ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ
3.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
3.1.1 Двунитевые разрывы ДНК: индуктор
клеточной гибели
3.1.2. Сигнальная функция двунитевых разрывов
ДНК
3.2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.2.1 Материалы и методы
3.2.2 Результаты и обсуждение
3.2.2.1 Морфологические изменения ЛКЧ и типы
комет
3.2.2.2 Репарация ДНК после действия этопозида
3.2.2.3 Нерепарированные ДР индуктор апоптоза
ЛКЧ
3.2.2.4. Топоизомераза II в покоящихся ЛКЧ
3.2.3 Заключение
Глава 4 ОДНОНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ, РЕПАРАЦИЯ ДНК И
ГИБЕЛЬ ПОКОЯЩИХСЯ ЛИМФОЦИТОВ
4.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
4.1.1 Однонитевые разрывы при апоптозе
4.1.2 Репарация ДНК и апоптоз
4.2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.2.1 Материалы и методы
4.2.2 Результаты и обсуждение
4.2.2.1 Действие Н202 на ДНК лимфоцйтов
4.2.2.2 Гибель ЛКЧ, индуцированная Н202
4.2.2.3 Роль РАДР и ЫАш в репарации ДНК
4.2.2.4 Гибель ЛКЧ в условиях подавления
репарации ДНК никотинамидом
4.2.2.5 Репарация ДНК и некротическая гибель ЛКЧ
4.2.3 Заключение
Глава 5 ВЫВОДЫ
Глава 6 Литература

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1. Актуальность проблемы.
С открытием программированной клеточной смерти (апоптоза) как альтернативы некроза проблема связи первичных повреждений ДНК с гибелью клетки приобрела более конкретные очертания и формулируется как проблема связи типов повреждений ДНК с формами клеточной гибели (проблема включает в себя и механизм трансдукции первичного сигнала).
„Исследования в этой области предполагают 3 варианта ответа на поставленный в проблеме вопрос
(1) Апоптоз является универсальным механизмом программированной гибели; вне зависимости от вида повреждений ДНК и природы повреждающего агента, гибель клетки завершается апоптозом (высокие уровни воздействия индуцируют некротическую гибель).
(2) Двунитевые разрывы ДНК (ДР), будучи главной причиной снижения колониеобразования
пролиферирующих клеток, являются основным типом повреждений, запускающих апоптоз.
(3) Повреждения ДНК сами по себе не являются причиной апоптоза, но запускают механизм репарации, в ходе функционирования которого создаются условия для гибели клетки, генерируется сигнал, запускающий программу гибели.
Настоящая работа находится в русле последнего представления. К этому направлению исследований тесно примыкает так же весьма интересная и пока далекая от своего решения проблема взаимоотношения механизмов репарации и апоптоза. Повреждения ДНК,

В последнее время широкое распространение получил метод ДНК-комет, с высокой точностью регистрирующий повреждения ДНК в клетке [Fairbairn et al.1995, Тронов, Пелевина,1996, Olive,1999, Piperakis,1999]. Метод позволяет поклеточно определять одновременно повреждение ДНК и ее содержание в клетке.
История его становления насчитывает чуть больше 10 лет. К концу 80-х годов (время начала наших исследований) принципиальная схема метода была разработана в современном варианте [Ostling, Johanson, 1984, Ostling О, Johanson KJ. 1987, Singh, 1988]. Она включает в себя несколько последовательных процедур, представленных на рис.6. (1-3)Суспензия клеток (интактных или после воздействия) смешивается с агарозой, и смесь наносится тонким слоем на поверхность
микроскопического стекла. (4) После застывания геля стекло погружаются в лизирующий раствор, обеспечивающий лизис мембран и частичное высвобождение ДНК. В результате из каждой клетки формируются нуклеоиды, иммобилизованные в агарозе. (5) В постоянном электрическом поле свободные петли (сегменты) ДНК мигрируют (вытягиваются) к аноду, придавая нуклеоиду асимметрию. Любая обработка, способствующая высвобождению ДНК из ядра клетки (разрывы, протеиназа) увеличивает миграцию ДНК. (6) Стекла погружаются в нейтрализующий раствор (0.4 М