Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами

• Автор: Ковалева, Тамара Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 421 с.

Оглавление
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Основные представления о структуре и свойствах ферментов
1.2. Физико-химические свойства ферментов и особенности ферментативного катализа
1.3. Физико-химические свойства гликозидаз
1.4. Применение ферментов в промышленности, медицине, аналитических целях. Иммобилизация ферментов
1.5. Физико-химические аспекты катализа иммобилизованными ферментами
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Объекты исследований
2.2. Метод определения каталитической активности инулазы
с помощью резорцина
2.3. Определение молекулярной массы ферментов методом гель-хроматографии
2.4. Глюкозооксидазный метод определения каталитической активности глюкоамилазы
2.5. Методика сорбционной иммобилизации ферментов
2.6. Методика ковалентной иммобилизации с помощью
глутарового альдегида
2.7. Определение белка модифицированным методом Лоури
2.8. Количественное определение -Я-Я- и -ЯН- групп в белках
2.9. Количественное определение аминокислот с помощью аминокислотного анализатора
2.10. Хроматография аминокислот на бумаге
2.11. Экстракция микотоксинов из пищевых продуктов
2.12. Заражение пищевых продуктов и сырья раствором
чистого микотоксина
2.13. Подготовка образцов для анализа методом инфракрасной спектроскопии (ИКС)
2.14. Подготовка ионитов к иммобилизации
2.15. Подготовка к иммобилизации ионообменных волокон
2.16. Методика разделения веществ с помощью хроматографирования
на бумаге
2.17. Электрофоретическое разделение на бумаге окрашенных
веществ
2.18. У становка для кислотно-основного титрования
2.19. Определение числа ионогенных групп

ГлаваЗ. Результаты экспериментов
3.1. Исследование состава культуральной жидкости глюкоамилазного производства
3.2. Изучение сорбционной способности ионитов по отношению к глюкоамилазе
3.3. Исследование физико-химических свойств глюкоамилазы
3.4. Исследование кинетики ферментативного катализа
реакции гидролиза крахмала
3.5. Исследование действия четвертичных солей ди- и тетрагидрохинолина на структурно-функциональные
свойства глюкоамилазы
3.6. Иммобилизация глюкоамилазы на ионитах сорбционным
методом
3.7. Иммобилизация глюкоамилазы на ионитах химическими методами
3.8. Иммобилизация глюкоамилазы на некоторых анионитных
смолах
3.9. Очистка препарата инулазы
3.10. Физико-химические свойства инулазы
3.11. Определение величин рК диссоциирующих групп активного
центра инулазы
3.12. Исследование четвертичной структуры инулазы
3.13. Иммобилизация инулазы на ионообменных смолах
3.14. Влияние ионов двухвалентных металлов на структурнофункциональные свойства свободной и иммобилизованной инулазы
3.15. Кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными
и иммобилизованными амилазами
3.16. Воздействие мочевины и ее производных с хинолиновым циклом, ультрафиолетового и у-излучения на физикохимические свойства иммобилизованной инулазы
3.17. Разработка способа определения токсичности зернопродуктов
и комбикормов
3.18. О механизме действия и строении активного центра глюкоамилазы и инулазы
Основные выводы
Список литературы
Список сокращений
Приложение

Введение
Актуальность темы. Изучение любой проблемы в области познания механизмов жизнедеятельности обязательно связано с исследованием соответствующих ферментных систем, способных кинетически контролировать химические реакции и осуществлять регуляцию метаболических процессов. Успехи современной теории биологического катализа показали, что ферментативные реакции при всей их сложности протекают в полном соответствии с общими закономерностями обычных химических превращений. Объяснение огромных преимуществ, которыми ферментативный катализ отличается от небиологического гетеро- и гомогенного катализа, заложено фактически в исключительно сложной структуре макромолекулы ферментов и функционировании их активного центра. Химические группы, формирующие активный центр, как правило, сами по себе являются очень слабыми катализаторами соответствующих реакций, но включение этих группировок в состав полипептидных цепей белковых молекул приводит к появлению такой каталитической активности, которая превышает активность катализаторов небиологического происхождения на несколько порядков /1/.
В настоящее время не существует единой теории, объясняющей необычайно высокую специфичность и активность ферментных катализаторов. В изучении ферментов наиболее актуальными являются такие вопросы, как расшифровка их первичной структуры; влияние различных физикохимических факторов на конформацию белков и связанных с ней механизмов активации и инактивации ферментов; идентификация функциональных групп их каталитических центров; расшифровка молекулярных механизмов катализа. В последние годы особое внимание уделяют амилазам, физико-химические свойства которых были изучены на ранних этапах развития этимологии, причем их применение в пищевой, легкой промышленности и медицине помогло существенно изменить и усовершенствовать многие существующие технологии и создать новые. Однако кинетикотермодинамические аспекты действия ферментов на полимерные субстраты, а также особенности характера фермент-субстратных взаимодействий на достаточно протяженных участках активных центров амилаз изучены недостаточно.
Результаты многочисленных исследований ингибиторов ферментов, представляющих собой одну из систем регуляции активности клетки и универсальных оперативных систем контроля, а также защиты от собственных амилаз, обусловлены практической необходимостью поиска возможных медицинских препаратов.
Исследование некоторых кинетических аспектов ферментативных реакций в условиях регуляции скорости с помощью различных химических

T ("tense" - напряженное) - состояние с большей энергией взаимодействия протомеров в олигомере;
3) переход из одного состояния в другое происходит согласованно, т.
е. с одновременным изменением конформации всех протомеров в олигомере.
Как показано в работе Поповой С. В. /120/, для олигомерных ферментов, содержащих п активных центров, уравнение скорости ферментативной реакции имеет вид:
(1.2.8)

где О - конформационная функция, и Ух - скорости реакции катализа ферментом в состояниях В. и Т соответственно, причем

V» =———; (1.2.9)
Кк +8

V = Vе + —!—-9- И
V, у- + к:(8_81у
где Бо - концентрация субстрата в точке перегиба кривой.
Как правило, из данных по стационарной кинетике величины их определяют на основе линеаризации уравнения Михаэлиса в рамках одной из его известных модернизаций:
1 1 К
V V... V.x S'

(1.2.9.2)
V = V (1.2.9.3)
s к s
— = — +
V V угаа
max “ ma
(1.2.9.4)

Наиболее часто применяют график двойных обратных координат (— 0Т~Х
который обычно называют графиком Лайнуивера-Берка /121/. В настоящее время графическая обработка уравнения Михаэлиса применима лишь для визуальной иллюстрации соответствия экспериментальных данных уравнению (1.2.4). Для численного определения величин Ymax и Кт целесообразно использовать методики статистической обработки на ЭВМ, дающие помимо численных значений достоверные сведения о величинах статистических ошибок.