Биохимические и физико-химические свойства ключевой тополитической эндоглюканазы целлюлазного комплекса Chaetomium cellulolyticum

• Автор: Анкудимова, Наталия Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛАЗЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ
ГЛАВА 2. ГРИБНЫЕ И БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЕ СИСТЕМЫ.
ПРОДУЦЕНТЫ «НЕЙТРАЛЬНЫХ» ЦЕЛЛЮЛАЗ
ГЛАВА 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
3.1. Компонентный состав целлюлазных комплексов
3.2. Механизм действия целлюлаз
3.3. Доменная структура целлюлаз
3.4. Современные представления о классификации целлюлаз
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ И РЕГУЛИРОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ С ПОМОЩЬЮ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ МЕТОДОВ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
5.1. Исходные вещества
5.2. Аналитические методы
5.3. Методы определения активности
5.4. Определение активности ферментов с помощью окрашенных субстратов
5.5. Определение тополитической активности целлюлаз
5.6. Проведение ферментативного гидролиза микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозы
5.7. Определение состава продуктов реакции гидролиза МУФ-целлобиозида
5.8. Методы изучения стабильности целлюлолитических ферментов

5.9. Методы изучения адсорбционных характеристик ферментов
5.10. Определение кинетических параметров ферментов
5.11. Выделение и очистка индивидуальных целлюлолитических ферментов целлюлазного комплекса С. сеПиЫуйсит
5.12. Выделение рекомбинантной эндоглюканазы с молекулярной массой 25 кДа
5.13. Определение биохимических параметров очищенных ферментов
5.14. Определение молекулярно-массового распределения Р-глюкана ячменя
5.15. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго на целлюлозной матрице
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ
ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА СИасЮтшт сеПиЫуйсит. ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ
СПЕЦИФИЧНОСТИ
6.1. Схема очистки ферментов С. сеПиЫуйсит
6.2. Субстратная специфичность выделенных ферментов
ГЛАВА 7. ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ И СТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТОВ С. сеПиЫуйсит ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ И pH СРЕДЫ
7.1. pH- и температурные зависимости активности ферментов
7.2. Стабильность ферментов целлюлазного комплекса С. сеПиЫуйсит
ГЛАВА 8. КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА С. сеПиЫуйсит
8.1. Определение типа действия белков С. сеПиЫуйсит на основе полного ферментативного гидролюа карбоксиметилцеллюлозы и микрокристаллической целлюлозы
8.2. Изменение молекулярно-массового распределения р-глюкана при действии
целлюлаз С. сеПиЫуйсит

8.3. Кинетические параметры ферментов
8.4. Ингибирование продуктом реакции целлобиогидролазы целлюлазного комплекса C. cellulolyticum
8.5. Адсорбционные характеристики ферментов
8.6. Синергизм между эндоглюканазами и целлобиогидролазой
ГЛАВА 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ С. cellulolyticum
9.1. Тополитическая активность ферментов
9.2. Оценка влияния целлюлаз C. cellulolyticum на ресорбцию индиго
ГЛАВА 10. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ
ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 25 кДа
10.1. Получение рекомбинантного фермента
10.2. Свойства рекомбинантной Эндо
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

4. растворимый окрашенный субстрат РББ-КМЦ (КМЦ, окрашенная красителем Remazol Brilliant Blue R), p-тюкан ячменя производства фирмы «Megazyme» (Австралия).
5. натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ, средней вязкости), 4-метилумбеллиферил-целлобиозид (МУФ-целлобиозид, МУФ-Цг), 4-метилумбеллиферил-лакгозид (МУФ-лактозид), глюкуроноксилан из древесины березы, п-нитрофенил-{)-£>-глюкотфанозид (нНФГ), D-гтокоза, £>-целлобиоза, 5-глюконолактон, индиго производства фирмы «Sigma» (США).
6. моногидрат лактозы фирмы «Merck» (Германия).
7. декстраны с молекулярной массой от 20 до 250 кДа производства фирмы «Pharmacia» (Швеция)
8. о-дианизидин производства Донецкого завода химических реактивов.
Для определения концентрации глюкозы использовали пероксидазу хрена с удельной активностью 350 ед/мг (Rz=0,6) производства фирмы «Reanal» (Венгрия) и кристаллическую глюкозооксидазу с удельной активностью 380 ООО ед/г, полученную на Вильнюсском заводе ферментных препаратов.
Для приготовления буферных растворов использовали коммерческие препараты солей марок ч.д.а. и ос.ч. «Реахим» (Россия).
5.1.3. Носители, используемые при хроматографическом выделении ферментов
В качестве носителей для очистки ферментов использовали при ионообменной хроматографии DEAE-Toyopearl 650М (20-40 мкм, «Тоуо Soda», .Япония) и Macro Prep Q (190±40 мкм, «Bio-Rad», США), при обессоливании - Акрилекс П-4 («Reanal»), при