Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических и неорганических субстратов

• Автор: Фирсова, Юлия Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л ГЛЮКОЗООКСИДАЗА: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
1Л Л Глюкозооксидаза как окислитель глюкозы
1Л .2 Физические свойства
1Л.З Структура В
1Л .4 Стабильность
1Л.5 Ингибиторы
1Л .6 Восстанавливающие субстраты
1Л. 7 Механизм реакции окисления О-глюкозы
1Л. 8 Влияние pH на механизм реакции
1 Л.9 Практическое применение
1.2 ОРГАНИЧЕСКИЕ, НЕОРГАНИЧЕСКИЕ И МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ КАК МЕДИАТОРЫ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В БИОСИСТЕМАХ
1.2.1 Дикислород, как окисляющий субстрат глюкозооксидазы
1.2.2 Органические субстраты глюкозооксидазы
1.2.3 Неорганические субстраты глюкозооксидазы
1.2.4 Металлоорганические соединения как медиаторы электронного транспорта
1.2.5 Способы модификации фермента, поверхности электрода и медиаторов электронного транспорта
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 .ПРИБОРЫ И РЕАГЕНТЫ
2.2 МЕТОДЫ
2.2.3 Синтез солей феррициния
2.2.2 Кинетические исследования реакции окисления D-глюкозы солями феррициния, катализируемое глюкозооксидазой
2.2.3 Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой реакции глюкозоокси-дазного восстановления Fc PF6" в присутствии D-глюкозы
2.2.4 Определение активности глюкозооксидазы
2.2.5 Влияние этанола на каталитическую активность фермента
2.2.6 Влияние pH на кинетику глюкозооксидазного восстановления Fc PFY
под действием D-глюкозы
2.2.7 Приготовление растворов феррициния для изучения эффекта катионных, анионных и неионогенных ПАВ на каталитическую активность фермента. Кинетические измерения
2.2.8 Приготовление растворов н-бутилферрициния, содержащих тритон X-
100 и ДСН. Кинетические измерения
2.2.9 Приготовление растворов н-бутилферрициния в присутствии ЦТАБ
2.2.10 Влияние различных ПАВ на скорость поглощения дикислорода
2.2.11 Приготовление растворов катионов R-, S- энантиомеров 2-метилферроценкарбоновой кислоты и спектрофотометрические измерения
2.2.12 Приготовление растворов комплексов Os(III) и Ru(III), проведение спектрофотометрических измерений
2.2.13 Влияние гистидина и глутаминовой кислоты на скорость глюкозооксидазного восстановления [Os(4,7-Me2bpy)2Cl2]Cl под действием D-глюкозы
2.2.14 Эффект пиридина на пероксидазное восстановление комплекса Ru(bpy)2Cl2 под действием Н2О2
2.2.15 Получение апо-пероксидазы
2.2.16 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод А)
2.2.17 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод Б)

Глава 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЗЛ ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ И МЕХАНИЗМА ОКИСЛЕНИЯ В-
ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКО-ЗООКСИДАЗОЙ ЗЛ Л Формальная кинетика и механизм реакции ЗЛ.2 Поведение замещенных солей феррициния ЗЛ.З Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой ЗЛ .4 Влияние этанола на каталитическую активность глюкозооксидазы ЗЛ .5 Влияние pH на кинетику глюкозооксидазного восстановления НРс+РРб'
З Л .6 Обсуждение результатов на основании модели “шар-воронка”
ЗЛ.7 Энантиоселективное восстановление ионов феррициния, катализируемое глюкозооксидазой
3.2 РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ ПАВ В КИНЕТИКЕ КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ О- ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ И Н-БУТИЛФЕРРИЦИНИЯ
3.2.1 Влияние ПАВ на скорость ферментативного поглащения кислорода
3.2.2 Влияние концентрации феррициния на скорость его ферментативного восстановления в присутствии ПАВ
3.2.3 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона феррициния под действием О-глюкозы
3.2.4 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона н-бутилферрициния под действием О-глюкозы
3.3 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ОКИСЛЕНИЯ О-ГЛЮКОЗЫ КОМПЛЕКСАМИ [МІІІ (Ги)2С12]+, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗОЙ ( М=Оз, Ли, ЕЬ=2,2’-БИПИРИДИН И 1,10-ФЕНАНТРОЛИН)
3.3.1 Определение стехиометрии и кинетических порядков реакции глюкозооксидазного восстановления комплексов осмия, рутения по разным реагентам

20. Гемин, модифицированный аминопропилимидазолом был любезно предоставлен сотрудниками кафедры химии Сельскохозяйственного университета города Ден-марка (Дания).
Все кинетические исследования проводились на спектрофотометрах Specord М-40 и Shimadzu U-160A. Для электрохимического эксперимента использовалась трехэлектродная термостатированная стеклянная ячейка
объемом 10 мл со стеклоуглеродным рабочим электродом, насыщенным каломельным электродом сравнения и платиновым вспомогательным электродом. Для регистрации электрохимических сигналов использовался потенциостат IPC-2.
Для изучения влияния ПАВ на скорость поглощения кислорода в присутствии глюкозооксидазы и D-глюкозы использовали кислородный анализатор ВО detector (Эстония).
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Синтез солей феррициния
Синтез феррициния и его производных проводили по схеме 2.2.1 в соответст-
Схема 2.2.1.
вии с методикой [94]. Для этого 0.5 г (1.5x10'3 моль) ферроцена растворили в 10 мл 98%-ой НгБОф Полученный раствор оставили на один час при комнатной температуре, после чего раствор был прилит к 50 мл воды. Раствор отфильтровали и добавили 10 мл насыщенного раствора КРРб. Выпавший кристаллический фиолетовый осадок отфильтровали и оставили сушиться на воздухе в течение двух дней. Выход полученного гексафторфосфата феррициния (НРс+РРб") составлял 0.4 г (80%). Аналогично были получены и другие замещенные соли феррициния (метил-, этил-, 1,Г-диэтил-, н-бутил-, трет-пентил- и хлорферрициний).