Ферментативные свойства pPHK метилтрансферазы RSMD Escherichia coli

• Автор: Сергеева, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Список сокращений
Литературный обзор
Морфологические элементы рибосомы
Нуклеолитический процессинг рРНК
Сборка ЗОБ субчастицы рибосомы
Рибосомные белки ЗОв субчастицы
Интермедиаты сборки ЗОБ субчастицы
Процесс сборки центрального домена 16Б рРНК
Кинетика связывания рибосомных белков с ЗОБ субчастицей
Сборка 508 субчастицы рибосомы
Рибосомные белки 508 субчастицы
Интермедиаты сборки 508 субчастицы
Белки, участвующие в сборке рибосомы
Хеликазы
Шапероны
вТРазы
Модификация нуклеотидов рРНК
Модификация 16БрРНК ЗОБ субчастицы
т62А1518ит62А1519
т20966 и т5С967
Модификация 16БрРНК, происходягцая после сборки 308 субчастицы
т70527
т2О1207
т4Ст1402
т3Ш498
т5С1407
пЛіШб

Модификация 23БрРНК 505 субчастицы
¥516 в ЗОБ субчастице; ¥746, ¥955, ¥1911, т3¥1915, ¥1917, ¥2457,
¥2504, ¥2580, 2604, ¥2605 в 50Б субчастице
ш'0745
т5и747 и т5Ш939
т6А1618
т201835
т5С1962
т6А2030, т7О2069, С*2501, 02449
вт2251, Ст2498, ит2552
т202445
т2А2503
Ферментативная модификация рибосомных белков
Результаты и обсуждение
Постановка задачи
Образование стабильного комплекса между метитпрансферазой КлтО и 308 субчастицами рибосомы
Комплексообразование в присутствии мРНК, тРНК и факторов инициации
Применение ЯлтИ для сайт-специфического введения флуоресцентной метки
Определение константы диссоциации комплекса 308 субчастиц
с метилтрансферазой ЯвтО
Ферментативные свойства метилтрансферазы ЯвтО
Химический и ферментативный пробинг комплекса Явтй с 308 субчастицами
Изучение активного центра метилтрансферазы ЯшИ с помощью мутагенеза
Заключение
Материалы и методы
Реактивы
Буферы и растворы
Биопрепараты
Выделение ЗОБ, 708 субчастиц рибосом иТ и АЯгтВ
Введение мутаций в метилтрансферазу ЯлтО

Трансформация клеток E. coli
Выделение рекомбинантных белков RsmD и мутантов PPF128-130AAS, F130S, РР128-129АА, D58A, D58AJPP128-129АА
Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ
Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD
методом гель-фильтрации
Выделение комплекса метилтрансферазы RsmD с 30S ArsmD
методом ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы
Иммуноблотинг
Определение степени связывания тРНК с рибосомами
с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры
Комплексообразование в присутствии факторов инициации, mPFIK, мРНК
In vitro алкинилирование
Реакция Хъюсгена
In vitro инициация трансляции
Определение константы диссоциации комплекса 30S субчастиц с RsmD
Определение кинетических свойств метилтрансферазы RsmD
и мутантов PPJ28-129AA, D58A, D58A/PP128-129AA
Математическая обработка данных,
полученных с помощью счетчика радиоактивности
Химический и ферментативный пробит комплекса RsmD с 3OS субчастицами
Измерение скорости роста штаммов wt и ArsmD в условиях повышенной экспрессии метилтрансфреразы RsmD и ее неактивного мутанта PPF128-130AAS
Изотермическое калориметрическое титрование
Выводы
Список литературы

синтезируемая пол и пептидная цепь. Тоннель и его окружение представляют собой мишень для различных регуляторных пептидов, а также антибиотиков. Аденозин 1618 находится в ближайшем окружении тоннеля, близко к рибосомному белку 1,22. Нуклеотид А1618 сближен с модифицированными нуклеотидами т'0745, Ч/746, т5Ш47. Этот кластер модифицированных нуклеотидов участвует в остановке трансляции специализированными пептидами, а также сближен с местом взаимодействия некоторых антибиотиков с рибосомой [91].
Метилтрансфераза ШтР метилирует аденозин 1618 по экзоциклической аминогруппе в 6 положении. По своей вторичной структуре ШтР похожа как на Ы6-А, гак и на N2-0 метилтрансферазы. Субстратом для ШтР являются как 238 рРНК, так и 1дС1-коровые частицы, содержащие 23Б рРНК и рибосомные белки Ь2, 1.3. 1.4. ЫЗ, 1Л7, 1.20, Р21. Ь22, 1.23. 1.29 и 1.34. Рибосомные белки Р22 и 1.34 располагаются на расстоянии 15 А от А1618. Возможно, их роль заключается в конформационных изменениях рРНК, что приводит к доступности А1618 для модификации [92). Тогда как рибосомные белки 1.27. 1,15, Ь24 могут отвечать за образование тоннеля, делая А1618 недоступным для модификации. Дслеция ближайшего к А1618 рибосомного белка 1,22, приводит к возникновению устойчивости к действию антибиотика эритромицина.
Рис. 35. Расположение т6А 1618 в структуре 50Б субчастицы рибосомы. Показан срез через центр 50Б, пептидный туннель расположен параллельно оси Ъ.
системой водных каналов большой субчастицы рибосомы (рис. 35). Инактивация метилтрансферазы ШтР приводит к умеренному замедлению роста клеток [91].
Метальная группа т6А1618 находится в контакте с пептидным тоннелем и