Клонирование генов полипептидных нейротоксинов яда членистоногих

• Автор: Липкин, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
«МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ»
2.1 Введение
2.2 Анализ структуры сигнальных пептидов и 3’- нетранслируемых последовательностей кДНК, кодирующих токсины скорпионов
2.3 Анализ кодирующей последовательности кДНК
2.4 Клонирование геномной ДНК
2.5 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей токсинов скорпионов, выведенных на основе последовательности их кДНК
2.6 Семейства гомологичных токсинов из яда паукообразных
2.7 Пространственное строение токсинов пауков
2.8 Заключение
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выделение и анализ РНК из ядовитых желез пауков и тельсонов скорпиона
3.2 Семейство токсинов из яда скорпиона О. scrobiculosus
3.2.1 Синтез первой цепи кДНК на основе poly (А)+-мРНК чёрного скорпиона
3.2.2 Клонирование кДНК, кодирующей Os3 близкородственные полипептиды
3.2.3 Нуклеотидные последовательности кДНК семейства Os3R
3.2.4 Анализ аминокислотных последовательностей семейства Os3R
3.2.5 Масс-спектрометрический анализ цельного яда Orthochirus scrobiculosus
3.2.6 Клонирование кДНК, кодирующей полипептидный инсектотоксин Osl-1 из яда скорпиона О. scrobiculosus
3.2.7 Нуклеотидная последовательность токсина Osl
3.2.8 Структурный анализ аминокислотной последовательности инсектотоксина Osl-1 из яда чёрного скорпиона
3.3 Семейство полипептидных инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina
3.3.1 Клонирование кДНК, кодирующих семейство инсект-специфических нейротоксинов из яда паука S. florentina
3.3.2 Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих семейство инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina
3.3.3 Структурный анализ аминокислотных последовательностей семейства инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina

3.3.4 Анализ аминокислотной последовательности токсина ЭРИ
3.4 Низкомолекулярные полипептиды из яда паука каракурта (1_а1гос!есЩз тайапэ Фес1еатдийа1и$)
3.4.1 Клонирование кДНК, кодирующей низкомолекулярные белковые копоненты яда Ба?гос/есФ5 таапв ?гес1еатдиШи8
3.4.1.1 Синтез кДНК
3.4.1.2 Получение библиотеки кДНК в плазмидном векторе рБР65
3.4.1.3 Поиск клонов, содержащих ген низкомолекулярного белка
3.4.2 Нуклеотидная последовательность структурного гена низкомолекулярного белка
3.4.3 Анализ аминокислотной последовательности низкомолекулярного белка
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1 Материалы
4.1.1 Оборудование
4.1.2 Реактивы и ферменты
4.1.3 Биологический материал
4.1.4 Олигонуклеотидные зонды
4.1.5 Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
4.1.6 Микробиологические среды и растворы
4.1.7 Буферные растворы для проведения электрофореза
4.1.8 Растворы для приготовления ПААГ
4.1.9 Растворы для гибридизации нуклеиновых кислот
4.1.10 Фотографические растворы
4.2 Методы
4.2.1 Приготовление раствора тРНК
4.2.2 Выделение РНК и ее анализ
4.2.3 Синтез кДНК
4.2.4 Получение библиотеки кДНК
4.2.5 Скрининг библиотеки кДНК с помощью радиактивно меченых зондов
4.2.6 Выделение и анализ клонов, дающих положительный сигнал гибридизации
4.2.7 Приготовление компетентных клеток для электропорации
4.2.8 Выделение высокоочищенной суперскрученной плазмидной ДНК
4.2.9 Клонирование кДНК методом З’-концевой амплификации в ПЦР
4.2.10 Отбор рекомбинантных клонов
4.2.11 Определение нуклеотидной последовательности кДНК по методу Максама-Гилберта (на твердом носителе)
4.2.12 Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера
4.2.13 Компьютерный анализ нуклеотидных и белковых последовательностей
4.2.14 Масс-спектрометрический анализ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выделение и анализ РНК из ядовитых желез пауков и тельсонов
скорпиона
Одним из эффективных способов поиска и структурного исследования близкородственных полипептидных нейротоксинов является клонирование кДНК, кодирующей эти полипептиды. При этом, в качестве матрицы для синтеза кДНК используют мРНК, выделяемую из ядовитых желёз пауков или скорпионов. Такой подход позволяет избирательно клонировать только те гены, которые экспрессируются, и, следовательно, соответствующие токсины должны присутствовать в ядовитом секрете паукообразных.
По своему морфологическому составу ядовитые железы пауков и тельсоны скорпионов очень похожи. Поэтому суммарную РНК из них выделяли по одинаковой схеме. Важнейшим условием получения интактных препаратов РНК является быстрая и полная инактивация РНКаз, присутствующих в любом биологическом материале. Для этого использовали сильные денатурирующие агенты, такие как, гуанидинизотиоцианат, гуанидин-гидрохлорид, мочевину и фенол, а также восстанавливающие соединения - (3-меркаптоэтанол. Важно также, чтобы оборудование, посуда и растворы, контактирующие с препаратами РНК, не содержали активных РНКаз. Для их разрушения стеклянную и металлическую посуду прогревали при 150-200 °С, пластик и растворы обрабатывали диэтилпирокарбонатом. Выбор оптимального метода выделения РНК нередко производится эмпирически для определенного типа биологического материала. При работе с биологическим материалом, богатым хитином (ядовитые железы пауков,