Структурно-функциональная организация Са-АТФазы плазматических мембран человека

• Автор: Пестов, Николай Борисович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
ГЛАЗА 1. Са-АТФазэ плазматических мембран (Обзор литературы)
1.1. Очистка и реконструкция
1.2. Общая функциональная характеристика
1.3. Топология молекулы
1.4. Регуляция активности аутоингибиторным доменом
1.5. Другие механизмы модуляции активности
1.6. Разнообразие изоформ, альтернативный сплайсинг, тканеспецифичность и регуляция экспрессии in vivo
1.7. Системы клеточной экспрессии и сайт-направленный мутагенез
1.8. Медицинские аспекты
ГЛАВА 2. Исследование структурно-функциональной организации Са-АТФазы плазматических мембран при помощи фагового дисплея, иммунохимических, белкозоинженерных методов (Результаты и их обсуждение)
2.1. Получение и свойства фрагментов РМСА
2.3. Тонкое картирование эпитопов моноклональных антител к РМСА
2.4. Структурно-функциональные соответствия РМСА
2.5. Общий эпитоп РМСА и АРР
2.6. Применение С-концевого фрагмента РМСА для продукции и аффинной очистки химерных белков
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы
3.2. Методы исследования Выводы Благодарности
Список сокращений Список литературы
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки ключевая роль принадлежит ионам Са. В основе регуляторного дейстзия ионов Са лежит изменение внутриклеточной концентрации "мессенджера", которая внутри клетки приблизительно в 10000 меньше, чем снаружи. Первостепенную роль в поддержании такого градиента концентрации иона играет Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА) — система активного транспорта, использующая энергию АТФ для удаления избыточных количеств кальция. Нарушение внутриклеточного гомеостаза иона вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне всего организма является причиной развития многих тяжелых заболеваний. Поэтому изучение механизмов гомеостаза кальция, а в том числе механизма функционирования РМСА, относится к числу фундаментальных проблем физиологии, медицины и физико-химической биологии.
Цель работы. Основной задачей данной работы явилась характеризация моноклональных антител к Са-АТФазе плазматических мембран человека фРМСА) с использованием различных методов, в том числе картирование эпитопов при помощи фагового дисплея. Зная расположение эпитопов моноклональных антител в первичной последовательности РМСА, предполагалось проведение исследований структуры РМСА — трансмембранной топологии.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной работы помимо достижения первоначальных задач (картирования эпитопов моноклональных антител) удалось получить неожиданные интересные результаты. Прежде всего нужно отметить теоретическое предсказание и экспериментальное подтверждение существования общего эпитопа четвертой изоформы Са-АТФазы плазматических мембран человека (ИРМСА4) и предшественника р-амилоида. Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена РМСА для биотехнологических целей — аффинной очистки рекомбинантных белков.

ГЛАВА
Са-АТФаза плазматических мембран (Обзор литературы)
Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА, кальциевый насос) — интегральный мембранный белок, обнаруженный в клетках эукариот: животных и растений. Ее функция — поддержание внутриклеточного кальциезого гомеостаза — исключительно важна для нормальной жизнедеятельности. Используя энергию АТФ, РМСА переносит ионы Са за пределы клетки против 10000-кратного градиента концентрации.
После обнаружения Са-зависимой АТФазной активности в мембранах эритроцитов [1] и ее связи с транспортом Са [2], наиболее важными, ключевыми этапами в исследованиях РМСА можно назвать:
1. Открытие активирующего эффекта кальмодулина на РМСА [3,4]
2. Разработка процедуры очистки РМСА на иммобилизованном капьмодулине
[5].
3. Определение нуклеотидной последовательности кДНК РМСА — дедукция аминокислотной последовательности с немедленным открытием существования нескольких изоформ фермента [6-8]
4. Локализация кальмодулин-связывающего домена РМСА [9].
Опубликовано немало обзоров, посвященных РМСА [10-25], в данной работе
сделана попытка разностороннего охвата всей научной литературы, связанной с исследованиями этого интересного фермента.
1.1. Очистка и реконструкция РМСА.
Попытки выделить РМСА такими методами, как ионобменная хроматография и гель-фильтрация оказались неудовлетворительными для получения высокоочищенного активного препарата [26]. РМСА может быть получена з довольно чистом виде из мембран эритроцитов при помощи солюбилизации ее в неионном детергенте и аффинной хроматографии на иммобилизованном капьмодулине с элюцией ЭДТА. Впервые это удалось сделать а Швейцарии Ниггли. используя тритон Х-100 [5], а позднее — и с использованием дезоксихолата [27]. Авторами был получен белок с электрофоретической подвижностью 125 кДа и примесью 205 кДа (наиболее вероятно — димер РМСА, его количество возрастает при длительном хранении). Выход общей активности составил 19.5% с обогащением в 50G раз. [5]. Позднее

образовывать мультибелковые комплексы. Действительно показано взаимодействие с ИРМСАДЬ с гуанилаткиназой при помощи дрожжевой дзухгибридной системы [320].
Для понимания физиологической роли различных изоформ прежде асего необходимо исследование тканеспецифичной экспрессии соответствующих генов. Прежде всего надо отметить, что присутствие РМСА показано фактически для всех тканей млекопитающих. При помощи детекции транскриптов (ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг) или самого белка (иммуноблоттинг, иммуногистохимия, измерение активности) показано присутствие РМСА в самых различных тканях: слизистой тонкого кишечника (с большим содержанием в проксимальных отделах) [312-324], скелетных мышцах [36,80,299,325,326], слизистой желудка [299,309], аорте [299], гладкой мышце [78,299,327], тромбоцитах [328,329], Т-лимфоцитах [330], мезангиальных клетках [331], амилобластах [332], культивируемых остеобластах [333], почках [323,334-336], поджелудочной железе [337], слюнных железах [338], глазе [339,340], в том числе в эпителии роговицы [341], улитке [342], в том числе в Кортиезом органе [343], плаценте [344,345], сердце [309,345], печени [43,309,346,347], желтом теле [348], паращитовидной железе [349], адипоцитах [350], щитовидной железе [346].
В то же время уровень экспрессии различных изоформ и сплайсинговых вариантов в разных клетках организма может сильно различаться. Несмотря на большое количество исследований по тканеспецифической экспрессии изоформ и распределения альтернативных транскриптов, полученные на сегодняшний день данные выглядят довольно разрозненными, их трудно объединить в какую-либо систему.
Первоначальные исследования распределения транскриптов з тканях крысы проводили при помощи Нозерн-блоттинга РНК матки, мышц, сердца, легких, мозга, печени, селезенки, семенников, желудка, кишечника и поджелудочной железы [295,351]. Показано, что ген РМСА1 экспрессирован во всех тканях, причем высокий уровень экспрессии характерен для мозга, легких и кишечника и очень низкий — для семенников, поджелудочной железы и печени. Для РМСА2 обнаружен мощный сигнал в РНК мозга; слабый — в сердце, в остальных органах экспрессия почти незаметна. Для РМСАЗ мощный сигнал — в мозге, сильный — в скелетных мышцах, слабый — в семенниках и отсутствие — в других тканях. Для РМСА4 — хороший сигнал в матке и желудке, слабый — в кишечнике, мозге, семенниках, отсутсвие — в печени и поджелудочной железе.
Позднее исследовали экспрессию генов РМСА и сплайсинговых вариантов преимущественно при помощи ОТ-ПЦР. Здесь нужно отметить, что результаты, полученные разными исследователями, зачастую сильно различаются из-за отсутствия стандартизации источников тканей, методов их препарирования и способов анализа.