Структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-лигандами

• Автор: Рязанова, Александра Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 193 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Структурно-функциональная характеристика доменов, входящих в состав
С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз (Обзор литературы)
1Л. Структурно-функциональная характеристика метилтрансферазного домена у
прокариотических и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
1Л Л. Структурная организация метилтрансферазного домена
1Л .2. Механизм метилирования ДНК
1.2. ДНК-метилтрансферазы с неколькими метилтрансферазными доменами
1.3. Дополнительные функции С5-ЦИТОЗИНОВЫХ ДНК-метилтрансфераз у прокариот
1.3.1. Дезаминирование остатков цитозина и 5-метилцитозина
1.3.2. Эндонуклеазная активность
1.3.3. Топоизомеразная активность
1.3.4. С5-цитозиновые ДНК-метилтрансферазы как факторы транскрипции
1.4. Домены эукариотических ДНК-метилтрансфераз
1.4.1. Функциональные домены ОптП млекопитающих
1.4.1.1. ОМАРІ-связывающий домен
1.4.1.2. РСМА-связывающий домен
1.4.1.3. ЫПЛГдомен
1.4.1.4. СХХС-домен
1.4.1.5. ВАН-домены
1.4.1.6. Кв-линкер
1.4.2. Функциональные домены ферментов семейства ОппйЗ млекопитающих
1.4.2.1. Р’¥УР-домен
1.4.2.2. АОБ-домен
1.4.3. Домены ДНК-метилтрансфераз растений
ГЛАВА 2. Структурно-функциональная характеристика ДНК-метилтрансферазы БвоВ
и ее комплексов с ДНК-лигандами (Результаты и их обсуждение)
2.1. Характеристика объектов исследования
2.2. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз
2.3. Структура апо-формы ДНК-метилтрансферазы 8зо11 и ее делеционных
мутантов

2.3.1. Определение олигомерного состояния ДНК-метилтрансфераз БзоП и Ы1аХ методом гель-фильтрации
2.3.2. Структура низкого разрешения ДНК-метилтрансфераз №аХ и БзоН
2.3.3. Структурная характеристика К-концсвой области 88о11-подобных ДНК-метилтрансфераз
2.3.4. Конформационная подвижность линкера, соединяющего домен ДНК-метилтрансферазы 8зо11, ответственный за регуляцию транскрипции, с доменом, ответственным за метилирование
2.4. Метилтрансфераза ВвоН как фермент, модифицирующий ДНК
2.4.1. Взаимодействие ДНК-метилтрансферазы 8зо11 с кофактором и аналогом кофактора
2.4.2. Особенности комплексообразования ДНК-метилтрансферазы 8во11
с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования
2.4.2.1. Комплексообразование
2.4.2.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы БвоП с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования
2.4.2.3. Структура низкого разрешения комплекса ДНК-метилтрансферазы
8во11 с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования
2.4.2.4. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы ВбоП с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования
2.4.2.5. Кинетика «выпетливания» гетероциклического основания при взаимодействии ДНК-метилтрансферазы ВэоП с ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования
2.5. ДНК-метилтрансфераза 8зо11 как фактор транскрипции: структурные особенности комплексов с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок
2.5.1. Комплексообразование N-концевой области Бво 11-подобных ДНК-метилтрансфераз с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок
2.5.2. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы 8зо11 с ДНК-дуплексами, содержащими регуляторный участок
2.5.3. Сближенность белковых субъединиц в комплексе ДНК-метилтрансферазы БзоП с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок
2.5.4. Взаимное расположение доменов ДНК-метилтрансферазы БвоН в комплексах с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок
2.5.4.1. Ковалентная «сттгивка» остатков цистеина с помощью ВМОЕ и ВМ[РЕО]4

2.5A.2. Фотокросслинкинг с помощью ВРМ
2.5.5. Модель взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком ДНК
2.5.6. Значение структурной организации комплекса ДНК-метилтрансферазы SsoII с регуляторным участком для функционирования ДНК-метилтрансферазы
SsoII в качестве фактора транскрипции
2.6. Сравнение эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с
ДНК-лигандами
2.6.1. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-лигандами
2.6.1.1. Анализ кинетики методом акустической детекции на
пьезоэлектрическом сенсоре
2.6.1.2. Анализ кинетики методом «остановленного потока»
2.6.2. Сравнение сродства ДНК-метилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим участки узнавания, в равновесных условиях
2.6.3. Особенности существования системы рестрикции-модификации SsoII в клетке
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Приготовление компетентных клеток
3.3.2. Трансформация клеток методом теплового шока
3.3.3. Экспрессия белков
3.3.4. Выделение и очистка белков
3.3.5. Определение молекулярной массы белков методом гель-фильтрации
3.3.6. Определение вторичной структуры белков методом спектроскопии кругового дихроизма
3.3.7. Получение структуры низкого разрешения методом малоуглового
рассеяния рентгеновских лучей (SAXS)
3.3.8. Анализ эффективности взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с кофактором методом измерения собственной флуоресценции белка
3.3.9. Конструирование 32Р-меченных ДНК-дуплексов
3.3.10. Анализ кинетики метилирования ДНК-субстрата ДНК-
метилтрансферазой SsoII

большое число доменов входит в состав МТазы Оппи 1 млекопитающих. Они отвечают за модуляцию МТазной активности, распределение белка в клетке и взаимодействие с разнообразными белками, выполняющими широкий спектр функций.
N-концевля область
DMAP1-
< ВЯЗ ЫВ .'ІЮЩ1Ш NLS
домен X
PCNA
< ВЯЗЫВ МОЩШЇ
домен
С-концевяя область (ответетвенная эя метилирование)
PBHI)
KG-линкер
HTTTT
СХХС ВАН ВАН I IV VI ТИ
Œ пи 1 ПІ
PWWP .ADD I IV VT УШ IX X
III 1 ПІ

IX х
Dnnitl
Dnniüa
DnmOb
FWWP ADD I IV VIУШ IX X
ЩШЮЇЇ
.ADD І IV T VIII
Dnmt3L
Рис. 1.15. Структурная организация ДНК-МТаз млекопитающих. В N-концевой части белков показаны домены и функционально важные участки, в С-концевой части выделены консервативные мотивы, характерные для С5-ДНК-МТаз (по [129]).
1.4.1. Функциональные домены Dnmtl млекопитающих
Dnnitl состоит из 1620 аминокислотных остатков у мыши и из 1616 - у человека. Их аминокислотные последовательности идентичны на 85%. Молекула Dnmtl содержит следующие домены и функционально важные участки (перечислены, начиная с N-конца; рис. 1.15):
1) богатый зарядами домен, или домен взаимодействия с репрессором транскрипции DMAP1;
2) PCNA-связывающий домен (PCNA binding domain, PBD);
3) по крайней мере, три независимо функционирующих сигнала ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS) [ 127];
4) RFTS-домен (replication foci targeting sequence), также называемый TS- (targeting sequence), RFD- (replication foci domain) или TRJF-доменом (targeting to replication foci);
5) цистеин-богатый Zn-связывающий домен, также называемый СХХС-доменом;