Модифицированные субтилизины в сегментной конденсации пептидов

• Автор: Колобанова, Светлана Викторовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СУБТИЛИЗИНЫ
1.1. Общая характеристика субтилизинов
1.1.1. Строение молекулы субтилизинов
1.1.2. Активный центр и механизм катализа
1.1.3. Зона связывания субстрата и специфичность
1.2. Модификация субтилизинов
1.2.1. Модификация активного центра.
12.1.1. Тиолсубтилизин и субтилигаза
12.1.2. Селеносубтилизин
12.1.3. Ангидросубтилизин ' '
12.1.4. Модификация остатков Азр32, Шз64, Ахп155
1.2.2. Замены аминокислотных остатков вблизи активного
центра и в зоне связывания субстратов
1.2.3. Мутации в участках связывания ионов Са2+
1.2.4. Модификации в областях, удаленных от активного центра
1.3. Заключение
II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
II. 1.1. Получение и свойства тиолсубтилизина
II. 1.2. Тиолсубтилизин как катализатор синтеза различных пептидов
11.2. БВЗ-субтшизин как возможный катализатор синтеза пептидов
на твердом носителе
II.2.1. Выбор носителя
II. 2.2. Выбор спейсера
11.2.3. Модельная реакция
11.2.4. Двух- и трехстадийная конденсация пептидных сегментов
на аминосилохроме

11.2.5. Отщепление пептида от твердого носителя
II. 3. Заключение 99 III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы
III. 1. Получение и изучение ферментативных свойств
тиолсубтилизина
III. 1.1. Получение тиолсубтилизина
III. 1.2. Выделение тиолсубтилизина
III. 1.3. Определение ферментативной активности
III. 1.3.1. Определение активности по 01р-А 1а-А1а-1еи-рN3
III. 1.3.2. Определение активности по п-нитрофенилацетату
III. 1.3.3. Определение активности по азоказеину
Ш.1.4. Определение цистеина
111.1.5. Определение сулъфгидрилъных групп
III. 1.6. Гидролиз эфиров пептидов и аминокислот
тиолсубтилизином
III. 1.7. Синтез пептидов при помощи тиолсубтилизина
(типичная методика)
III. 1.8. Определение выхода пептидов методом ВЭЖХ
III. 1.9. Препаративный синтез 1-Рйе-С1у-ПН2
III. 1.10. Препаративный синтез 1-Р/1е-А1а-А1а-рЫА
Ш.2. Конденсация пептидов на твердом носителе под действием вПБ-субтилизина Ш.2.1. Получение комплекса БИБ-субтилизип
Ш.2.2. Синтез Н-МеиС1у-&у-аминосилохрома
111.2.2.1. Присоединение Вос-Ме1-01у-01у-ОН к аминосилохрому
111.2.2.2. Ацетширование свободных аминогрупп
III.2.3. Пикриновый тест
Ш.2.2.4. Удаление Вос-группы
Ш.2.3. Синтез Впр-А1а-А1а-Ьеи-Ме1-С1у-С1у-амино-
силохрома

Ш.2.4. Катализируемый субтилизином гидролиз пептидил-
аминосилохрома
Ш.2.5. Синтез Опр-А1а-А1а-Ьеи-Ме{-С1у-С1у-амино-
силохрома
111.2.6. Синтез Вое-А1а-А1а-1еи-Рйе-Мщ-С1у-С1у-
аминосилохрома
Ш.2.7. Отщепление пептида от твердого носителя с
помощью ВгСЫ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Таблица 4. Относительная каталитическая эффективность субтилигазы в реакциях конденсации амидов ди- и трипептидов с 8ис-А1а-А1а-Рго-Р11е-ё1с-РЬе->Ш2 [66]
Пептид Относительная эффективность Пептид Относительная эффективность
Н-у-РЬе-ИНг 0,8 Н-01у-Ьеи-1ЧН2 0
Н-А1а-Р11е-МН2 1,0 Н-РЬе-у-ИН 0
Н-Ьеи-Рйе-КНг 0,3 Н-Агё-С1у-1ЧН2 0
Н-Агё-РЬе-КН2 2,0 Н-А1а-Р11е-А1а-МН2 2
Н-01у-А1а-1ЧН2 0,1 Н-1хи-А5р-Р11е-14Н2 0
Субтилигаза успешно используется как катализатор синтеза протяженных пептидов и небольших белков [67, 68, 69, 70]. В работе [67] описан синтез рибонуклеазы А - фермента, состоящего из 124 аминокислотных остатков. Рибонуклеаза А была получена посредством катализируемых субтилигазой последовательных конденсаций шести этерифицированных пептидных фрагментов, содержащих от 12 до 30 остатков. Фрагменты выбирались с учетом специфичности субтилигазы. Ацилирующий компонент на каждой стадии конденсации был активирован амидом гликолилфенилаланина (ё1с-Р11е-КН2). Каждый пептидный сегмент на аминоконце был защищен изоникотиновой группой для предотвращения самоконденсации. Исследование каталитических свойств полученной рибонуклеазы показало, что фермент имеет биологическую активность. Субтилигаза также способна катализировать реакцию циклизации протяженных пептидов, состоящих из 12-31 аминокислотного остатка [71]. Циклизацию проводили по схеме:
субтилигаза
РШ-т'РзХААЭп-РзРгРг Н-Рх’Ра'РзЧАА-РзРзРг
СОЯ PH 8
Я = гликолилфенилаланиламид