Кооперативное взаимодействие олигонуклеотидов на комплементарных ДНК-последовательностях

• Автор: Адина-Зада, Абдуссалам
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава I. Физико-химические аспекты кооперативных взаимодействий в двух- и трехцепочечных комплексах нуклеиновых кислот (обзор литературы).
1. Количественные аспекты кооперативных взаимодействий в двуспиральных комплексах нуклеиновых кислот с одноцепочечным разрывом.
2. Изучение термодинамики образования трехцепочечных тандемных комплексов между олигонуклеотидами и ДНК с помощью метода "количественного аффинного расщепляющего титрования".
3. Заключение.
Глава II. Экспериментальная часть.
Глава III. Теоретические основы метода метода комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT).
1. Специфичность узнавания нуклеиновых кислот олигонуклеотидами и их производными.
2. Теоретические основы метода KAMT
3. Использование метода KAMT для определение параметров кооперативное™.
Глава IV. Определение параметров кооперативного взаимодействия олигонуклеотидов методом комплементарно-адресованного модифицирующего титрования (KAMT).

1. Определение методом KAMT параметров кооперативности в тандеме из трех олигонуклеотидов с эффекторами, содержащими остатки N-(2-гидроксиэтил)феназиния)
2. Исследование процессов взаимодействия эффектора Ei с мишенью
(Т26) методами задержки в геле и термической денатурации
3. Влияние структуры мишени на параметры кооперативности; контактная и неконтактная кооперативность
4. Подтверждение особенностей вторичной структуры мишени с помощью самомодификации

Глава V. Влияние модифицированных концевых нуклеотидов в области контакта олигонуклеотидов в тандемном комплексе и структуры мишени на величины параметров кооперативности.
1. Влияние структуры стыка олигонуклеотидов в тандемном комплексе
на величины параметров контактной кооперативности
2. Факторы, влияющие на величины контактной и неконтактной кооперативности; обсуждение возможности дискриминации ошибочных оснований в нуклеиновых кислотах с помощью тандемов олигонуклеотидов
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Как известно, стэкинг-взаимодействие гетероциклических оснований нуклеиновых кислот дает существенный энергетический вклад при формировании двух- и трехцепочечной структуры олиго- и полинуклеотидов. Природа этих взаимодействий не зависит от длины нуклеотидной цепи. Так, в водных растворах даже мононуклеозиды способны образовывать "стопки" за счет "вертикальных" взаимодействий с характерными величинами изменения свободной энергии диссоциации, не превышающими 1.5 ккал/моль. Природа сил, способствующих стэкинг-взаимодействию, несомненно связана с взаимодействием индуцированных диполей, образованных системой тс-электропов оснований. Поскольку стэкинг-структуры наиболее стабильны в водных растворах, то это приводит многих исследователей к выводу о том, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль в стабилизации стэкинговых структур. С другой стороны, наличие собственных дипольных моментов и проявление лондоновских дисперсионных сил дают заметный эффект, который, в частности, определяет различие энергий взаимодействий различных пар оснований.
Уже в 1966 году было обнаружено, что пуриновые нуклеозиды могут образовывать тандемы на комплементарном полинуклеотиде [1]. Аналогичным образом тандемные структуры образуют олигонуклеотиды [2]. Причиной образования тандемов являются кооперативные взаимодействия, обусловленные стэкингом гетероциклов соседних компонентов тандема. Это свойство было использовано Корана при создании им химико-ферментативного метода синтеза генов для соединения коротких олигонуклеотидов в один, более длинный с помощью ДНК-лигазы [3]. Разработанный им подход и на сегодняшний день лежит в основе завершающих этапов синтеза генов и их встраивания в плазмиды для последующего клонирования. В дальнейшем в большом цикле работ,

ДНК-мишень:
5'-ААААААвСААААААААААвАвАвАСАвА-3'
3 ' -ТТТТТТССТТТТТТТТТТСТСТСТСТСТ
Олигонуклеотиды:
17 5ТТТТТТ|МеСТмеСТТТСОТСААТСО (11 .звенный участок связывания)
2.7 5’СОАТТОАССТТТТТМеСТМеСТМеСТМеСТМеСТ (15-звенный участок связывания)
Рис. 3. Нуклеотидные последовательности участка 852-звенного ДНК-мишени и олигонуклеотидов. Подчеркнуты участки, образующие дуплекс; выделены жирным шрифтом участки, формирующие триплекс.
Измеренные методом КАРТ константы ассоциации олигонуклеотида 1.7 приведены в Таблице 9.
Таблица 9. Константы ассоциации и изменения свободной энергии при образовании триплексов*.
Олигонуклеотиды К, м-> АО, ккал/моль
1.7 1.7+ 2.7 (1.0 мкМ) (7.7±1.6) -105 (3.4±0.7) -107 -8.0±0.1 -10.2±0
*Буфер: 10 мМ ИаС!, 1 мМ спермидин, 25 мМ трис-ацетат, рН=7.0; 24°С.