Определение аминокислот и их моноаминовых метаболитов в физиологических жидкостях методом микроколоночной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием

• Автор: Королева, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 130 с.

Оглавление
Список сокращений
Введение и постановка задачи
Обзор литературы
Определение аминокислот
Определение продуктов метаболизма триптофана
Определение метаболитов тирозина
Определение гистамина
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Контроль качества в клиническом лабораторном анализе
Оборудование и реактивы
Оборудование
Реактивы
Методики, используемые при проведении эксперимента
Забор исследуемого материала
Приготовление растворов и калибровочных смесей
Идентификация компонентов
Построение калибровочных зависимостей
Обеспечение внутрилабораторного контроля качества
Полученные результаты и их обсуждение
Определени свободных аминокислот в физиологических жидкостях
1. Выбор способа депротеинизации
2. Влияние условий реакции дансилирования на выход свободных
аминокислот и дипептидов
2.1. Выбор значения pH реакционной смеси
2.2. Выбор концентрации ДНС-хлорида при патологически высоких концентрациях АК
2.3. Выбор длительности и температуры проведения реакции дансилирования
3. Хроматографическое разделение ДНС-аминокислот
3.1. Выбор pH элюента
3.2. Выбор молярности буфера
3.3. Выбор формы градиента

Методика определения свободных аминокислот в физиологических жидкостях
Определение метаболитов тирозина и триптофана
Выбор группы определяемых соединений
Выбор состава элюента
Концентрирование пробы на хроматографической колонке
Методика определения метаболитов тирозина и триптофана
Определение метаболитов триптофана (цикл ксантуреновой кислоты)
Выбор состава элюента
Концентрирование пробы на хроматографической колонке
Методика определения метаболитов триптофана (цикл ксантуреновой кислоты)
Определение катехоламинов плазмы крови
Выбор условий проведения реакции дериватизации
Выбор условий хроматографического разделения
Методика определения катехоламинов плазмы крови
Определение гистамина
Выбор условий проведения реакции дериватизации
Выбор условий извлечения гистамина из сыворотки крови
Выбор условий хроматографического разделения
Методика определения гистамина в сыворотке крови
Заключение
Выводы
Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5-ССК - 5-сульфосалициловая кислота АК - аминокислота
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГФА - гиперфенилаланинемия
ГХ - газовая хроматография
ДИП - ионизационно-пламенный детектор
ДНС -1-диметиламинонафталин-5-сульфонил- (ион)
ДНС-С1 - 1-диметиламинонафталин-5-сульфонил хлорид
ДНС-ОН - 1-диметиламинонафталинсульфоновая кислота
ДНС-ЫЩ - 1-диметиламинонафталинсульфониламид
ДПО - допустимый предел ошибки
ДФЭД- 1,2-дифенилэтилендиамин
КА - катехоламин
МС - масс-спектрометрия
МСД - масс-спектрометрический детектор
НБД-С1 - 4-хлор-7-нитробензо-2-1,3-оксадиазол
НБД-F - 4-фтор-7-нитробензо-2-1,3-оксадиазол
ОФДА - ортафталевый диальдегид
СКО - среднеквадратичное отклонение
ССК - сульфосалициловая кислота
ТСХ - тонкослойная хроматография
ТХУК - трихлоруксусная кислота
ФДНБ - флуородинитробензол
ФДНФАА - флуородинитрофенилаланинамид
ФИТЦ - фенилизотиоцианат
ФКУ - фенилкетонурия
ФМОК - 9-флуоренилметилхлорформиат
ФТГ - фенилтиогидантоин
ФТК - фенилтиокарбамил
ЦСЖ - цереброспинальная жидкость
ЭХД - электрохимический детектор

и более 30 % определений метаболитов в клинических лабораториях производится с помощью ВЭЖХ, и доля их за последние 10 лет выросла во много раз [115].
Разделение катехоламинов методом ВЭЖХ может осуществляться на колонках различных типов - нормально-фазовых [156], ионообменных [151, 157-162], обращенно-фазовых [163]. Причем в последнее время используется, в основном, обращенно-фазовая или ион-парная обращенно-фазовая хроматография.
Впервые обращенно-фазовая хроматография для разделения катехоламинов была предложена Molnar и Horvath [164], а ион-парная обращенно-фазовая - Eksborg и Schill [165]. С тех пор были опубликованы десятки работ, посвященных оптимизации разделения катехоламинов и их метаболитов путем подбора состава подвижной фазы, увеличения эффективности колонок [166-168]. Подробно исследовалось влияние pH, ионной силы буфера, типа и концентрации модификаторов, температуры, марки октадецильного сорбента, концентрации органического растворителя (обычно - ацетонитрила или метанола), возможности применения градиента pH без добавления ион-парных реагентов. В работе [166] предложен вариант компьютерной программы оптимизации подвижной фазы по шести параметрам: содержание ацетонитрила, октилсалициловой кислоты, этилендиаминтетрауксусной кислоты, диэтила-мина в элюенте, температура, pH цитратного буфера. В результате многочисленных экспериментов удалось добиться одновременного разделения 17 моноаминов за 22 минуты на колонке, упакованной Nucleosil Сы, 5 мкм, размерами 4.6 х 170 мм.
Детектирование разделенных с помощью ВЭЖХ катехоламинов и их метаболитов может проводиться различными способами:
Спектрофотометрическое детектирование в УФ области пригодно только для определения некоторых компонентов в моче, например ВМК, ГВК или метоксигидроксифенилэти-ленгликоля (МГФЭГ) [121, 127, 128]. Для компонентов плазмы чувствительности недостаточно, даже при применении методов концентрирования пробы.
Флуориметрическое детектирование нативной флуоресценции катехоламинов и их метаболитов возможно благодаря флуоресценции катехольной группы при УФ возбуждении на длине волны 285 нм с А. эмиссии в интервале 325 т 340 нм. Этот метод широко применяется для изучения тканевых экстрактов, а при применении предварительного концентрирования пригоден и для анализа некоторых компонентов плазмы и ЦСЖ [170-174], особенно в сочетании с электрохимическим детектированием [172]. Предел детектирования составляет около 400 пг [114].
Гидроксииндольный метод состоит в окислении катехоламинов до флуоресцирующих тригидроксииндолов (А и НА) и дигидроксииндола ДА с помощью гексацианоферрата (III).