Оценка экспрессии ангиотензин-превращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции с помощью МАТ

• Автор: Алексинская, Марина Анатольевна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 0 с. : 115 ил.

Глава 1. Обзор литературы. Этиология мужского бесплодия. Глава 2. Лабораторнодиагностические методы. Получение клеточных образцов. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека. Клетки перитонеальной жидкости. Фиксация сперматозоидов параформальдегидом. Разделение сперматозоидов в градиенте перколла. Выделение АПФ из клеток и тканей. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ангиотензинпревращающему ферменту. Выделение моноклональных антител. Выявление ангиотензинпревращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека методом проточной цитофлуорометрии. Выявление тестикулярной изоформы ангиотензинпревращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека методом флуоресцентной микроскопии. Выявление антиспермальных антител в эякуляте методом реакции смешанной агглютинации. Оценка уровня генерации свободных радикалов. Оценка акросомальной реакции методом проточной цитофлуорометрии. Статистическая обработка данных. Глава 3. Результаты и обсуждение. Характеристика специфичности моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту.


При попытках выявить связь между уровнем тАПФ и морфофункциональными характеристиками сперматозоидов были получены противоречивые результаты. В работе Капеко с соавторами была отмечена позитивная корреляция между активностью АПФ и подвижностью сперматозоидов человека . Такая же зависимость показана и для сперматозоидов крупного рогатого скота. Однако в более поздних работах выявлена негативная корреляция между активностью фермента и подвижностью сперматозоидов свиньи и человека , 9, . В то же время, КбЬп с соавторами 9 выявили отсутствие зависимости между уровнем активности АПФ и концентрациейморфологией сперматозоидов. Использование фармакологических ингибиторов АПФ не оказывало влияния на подвижность сперматозоидов 5, но негативно отражалось на результатах взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки , . Было показано, что тАПФ высвобождается с поверхности сперматозоидов во время капацитации и акросомальной реакции 9,. Несмотря на то, что исследования в этой области идут уже не один десяток лет, механизм влияния тАПФ на фертильность до сих пор не изучен. Анализ ферментативной активности и использование поликлональных АТ не позволяют выявлять тАПФ, а оценивают суммарную активностьэкспрессию как тестикулярной АПФ, экспрессирующейся на поверхности сперматозоидов, так и соматической АПФ, сорбируемой клетками из семенной жидкости. Таким образом, основной проблемой, связанной с определением роли тАПФ i viv, является отсутствие адекватных методов количественной оценки экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов. Следовательно, получение МАТ к тАПФ и изучение роли АПФ в репродукции является актуальной задачей. Оценка экспрессии ангиотензинпревращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции с помощью моноклональных антител. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела к тестикулярной изоформе ангиотензинпревращающего фермента. Разработать метод количественной оценки ангиотензинпревращающего фермента на поверхности сперматозоидов с помощью моноклональных антител. Определить зависимость между экспрессией тестикулярной изоформы ангиотензинпревращающего фермента и морфофункциональными характеристиками сперматозоидов. Количественно оценить экспрессию тестикулярной изоформы ангиотензинпревращающего фермента на поверхности сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции. Определить возможность продукции антител к АПФ у мужчин с иммунным фактором бесплодия. Впервые получены моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к нативной конформации тестикулярной изоформы АПФ человека. Показано, что слущивание тАПФ с поверхности живых патологически измененных сперматозоидов в ходе экспериментальных манипуляций приводит к ложнонегативным результатам при выявлении АПФ на поверхности клеток. Разработан способ количественной оценки тАПФ на поверхности сперматозоидов человека с помощью моноклональных антител 1Е с использованием метода проточной цитометрии. Установлено, что уровень тАПФ на поверхности сперматозоидов зависит от морфофункционапьных характеристик клеток. Максимальный уровень экспрессии тАПФ выявляется на поверхности морфологически измененных сперматозоидов и функциональноактивных сперматозоидов с нормальной морфологией. Снижение функциональной активности морфологическинормальных сперматозоидов уменьшение скорости поступательного движения и увеличение вероятности спонтанной АР, сопровождается снижением экспрессии тАПФ на их поверхности. Обнаружено что на поверхности морфологически нормальных сперматозоидов тАПФ локализуется в постакросомальной области головки, на шейке и средней части хвоста сперматозоидов. У сперматозоидов с патологически измененной морфологией головки тАПФ экспрессируется на всей поверхности головки клеток. Аутоантитела к АПФ в семенной жидкости фертильных доноров и пациентов с бесплодием иммунного и неиммунного генеза не выявлены. Показано, что уровень экспрессии тАПФ на поверхности сперматозоидов фертильных доноров выше, чем в фуппах пациентов с астенозооспермией и с бесплодием неясного генеза.