Разработка молекулярно-генетических методов для исследования β-лактамаз TEM- и SHV-типа у клинических штаммов энтеробактерий

• Автор: Эйдельштейн, Михаил Владимирович
• Шифр специальности: 14.00.31
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Смоленск
• Количество страниц: 123 с. : ил.

1.1. Механизм действия рлактамаз
1.2. Разнообразие и классификация рлактамаз .
1.2.1. Цефалоспориназы, слабо ингибируемые клавулановой кислотой группа 1
1.2.2. Пенициллиназы, цефалоспориназы и рлактамазы широкого спектра, ингибируемые клавулановой кислотой группа 2
1.2.3. Металлорлактамазы группа 3.
1.3 Распространенность ТЕМ и ЭНУ рлактамаз и их роль в развитии
резистентности к рлактамным антибиотикам
1.3.1. рлактамазы широкого спектра ТЕМ1, ТЕМ2 и ЭНХ1 .
1.3.2. Эволюция рлактамаз расширенного спектра.
Структурные и функциональные особенности ЕЗВЬ
1.3.3. Ингибиторорезистентные рлактамазы и ферменты, содержащие мутации характерные для 1РТ и ЕЭВЬ
Глава 2. Современные методы диагностики и типирования рлактамаз
2.1. Фенотипические методы
2.1.1. Хромогенные тесты для обнаружения продукции рлактамаз
2.1.2. Анализ антибиотикограммы
2.1.3. Скрининговые методы выявления Е8В1
2.1.4. Изоэлектрическое фокусирование ИЭФ
2.1.5. Исследование ферментативной кинетики
2.2. Генотипические методы
2.2.1. Секвенирование генов рлактамаз .
2.2.2. ДНКгибридизация
2.2.3. Использование ПЦР для исследования рлактамаз .
2.2.4. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ПДРФ
2.2.5. Одноцепочечный конформационный полиморфизм
2.2.6. Лигазная цепная реакция ЛЦР
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Контрольные штаммы микроорганизмов
3.2. Отбор клинических штаммов для исследования и определение чувствительности к антибиотикам
3.3. Выявление методом двойных дисков и с помощью Етестов
3.4. Выделение лактамаз и их анализ с помощью изоэлектрического фокусирования ИЭФ
3.5. Молекулярное типирование штаммов . i и . i
с помощью IПЦР
3.6. Амплификация и анализ рестрикционных фрагментов
ем генов .
3.7. Амплификация и анализ V генов
3.8. Секвенирование ЫаТЕМ генов
3.9. Определение кинетических параметров лактамаз.
3 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
3 Обработка и анализ электрофоретических данных.
Глава 4. Результаты и обсуждение .
4.1. Разработка методов для определения мутаций в генах ТЕМ и V лактамаз .
4.1.1. Амплификация и Ыаш генов
4.1.2. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР .
4.1.3. анализ рестрикционных фрагментов .
4.1.4. Анализ воспроизводимости профилей референтных лактамаз.
4.2. Исследование генетической вариабельности ТЕМ лактамаз широкого спектра с помощью метода .
4.2.1. Описание новых ЬаТЕМ генов Ьатi и тем7о У уропатогенных штаммов . i .
4.2.2. Исследование свойств ТЕМ .
4.3. Типирование у госпитальных штаммов . i с помощью
4.3.1. Клиникоэпидемиологическая характеристика штаммов
4.3.2. Определение лактамаз с помощью метода .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .
ВЫВОДЫ .
НАУЧНОПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ .
ЛИТЕРАТУРА


Большинство известных рлактамаз проявляет выраженную структурную гомологию с пенициллин связывающими белками ПСБ, что свидетельствует о наличии эволюционной взаимосвязи между ферментами этих групп . Подобно ПСБ, рлактамазы, содержащие остаток серина в активном центре, взаимодействуют с рлактамными антибиотиками с образованием эфирного комплекса. Однако, в случае рлактамаз этот комплекс подвергается быстрому расщеплению с высвобождением нативного фермента и инактивированной молекулы субстрата Рис. Различия между рлактамазами и ПСБ не всегда носят отчетливый характер, поскольку многие рлактамазы могут образовывать стабильные эфиры с рлактамами, выступающими в роли ингибиторов, а некоторые ПСБ обладают способностью к быстрому деацилированию, проявляя слабую гидролитическую активность в отношении отдельных рлактамных антибиотиков 1. Сравнительно небольшое число ферментов, известных как металлорлактамазы, осуществляют гидролиз рлактамного кольца с участием ионов цинка, находящихся в активном центре . Наиболее существенной особенностью рлактамаз этого типа является их активность в отношении карбапенемов 9. Рисунок 1. С момента открытия рлактамаз в г. Е. i описали процесс инактивации пенициллина в безклеточном экстракте культуры кишечной палочки 7, и до настоящего времени различными исследователями выявлено не менее 0 отличающихся в структурном и функциональном отношении ферментов, способных осуществлять гидролиз рлактамного кольца. За исключением нескольких видов клинически значимых микроорганизмов, среди которых важно отметить . Н. i, рлактамазы встречаются у подавляющего большинства бактериальных возбудителей .