Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка Альбумин-интерферон-альфа16, синтезируемого дрожжами Pichia pastoris

Изучение факторов, влияющих на секрецию и биологическую активность химерного белка Альбумин-интерферон-альфа16, синтезируемого дрожжами Pichia pastoris

Автор: Карабельский, Александр Владимирович

Шифр специальности: 03.03.04

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2010

Место защиты: Санкт-Петербург

Количество страниц: 198 с. ил.

Артикул: 4640649

Автор: Карабельский, Александр Владимирович

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ аИНТЕРФЕРОНЫ ЧЕЛОВЕКА ПРОДУКЦИЯ И ПУТИ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ обзор литературы.
1.1 Классификация интерферонов.
1.2 Интерферональфа.
1.2.1 Рецептор интерферонаальфа и сигнальная трансдукция.
.1.2.2 Молекулярный механизм действия интерферона.
1.2.3 Биологическая активность интерферонаальфа и его место в иммунном ответе
1.2.4 Клиническое применение
1.3 Интерфсроныальфа пролонгированного действия.
1.3.1 Пегилирование.
1.3.1.1 Физикохимические свойства ПЭГ и пегилированных белков
1.3.1.2 Фармакокинетические и фармакодиналшческие свойства ПЭГмодифицированных пептидов
1.3.1.3 Достоинства и недостатки ПЭГмодифицированных пептидов
1.3.2 Липидизирование.
1.3.3 Химерный белок АльбуминИФНа.
1.4 Создание продуцентов гетерологичных белков на основе микроорганизмов
1.4.1 Экспрессия гетерологичных эукариотических генов в дрожжах
1.4.2 Производство гетерологичных белков в метилотрофных дрожжах Р. раБгопБ.
1.5 Секреция рекомбинантных белков в дрожжах Р. раэЮт.
1.5.1 Процессинг синальной последовательности.
1.5.2 Гликозилирование
1.5.3 Фолдинг секреторных белков в ЭПР
1.5.3.1 Шапероны ЭПР.
1.5.3.2 Формирование дисульфидиых связей и цистранспептидилпролин изомеризация.
1.5.3.3 Деградация неправильно сложенных белков
1.5.3.4 Реакция несвернутых белков.
1.5.4 Внутриклеточные и экстраклеточяые протеазы дрожжей . vii и . i
1.5.4.1 Сериновые протеазы.
1.5.4.2 Аспарагиновые протеазы семейства япсинов.
1.5.4.3 Способы снижения активности протеолитических ферментов в дрожжевых системах экспрессии
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Штаммы.
2.1.2 Условия культивирования штаммов
2.1.3 Плазмиды.
2.2 Методы.
2.2.1 Трансформация бактерий . i
2.2.2 Трансформация дрожжей по методу
2.2.4 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.2.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.2.8 Полимеразная цепная реакция
2.2.9 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.
2.2. Определение концентрации белка
2.2. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии
2.2. Выделение фракции микросом и белков клеточной оболочки из клеток дрожжей . i
2.2. Осаждение белков
2.2. Разделение белков в растворе. Гельфильтрация.
2.2. Разделение белков путем адсорбции. Хроматографические методы
2.2. Определение биологической активности Альбурона
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Создание штамма дрожжей . i продуцента химерного белка Альбурона
3.1.1 Создание вектора экспрессии рР1С9ЛЬкы
3.1.2 Получение трансформантов дрожжей . i, несущих химерный ген .
3.1.3 Анализ продукции гетерологичного химерного белка трансформантами . i
3.2 Изучение динамики синтеза и секреции химерного белка.
3.3 Изучение влияния условий культивирования штамма 5 на уровень секреции Альбурона
3.3.1 Влияние аэрации и способа культивирования на выход биомассы клеток и уровень синтеза белка
3.3.2 Влияние неорганического фосфата на продукцию химерного белка
3.3.3 Влияние температуры и времени культивирования на уровень продукции химерного белка.
3.3.4 Анализ продуктов протеолиза Альбурона.
3.3.5 Анализ влияния , температуры, ЭДТА, ЭРГА, и состава культуральной среды на активность экстраклеточных протсаз дрожжей Р. i
3.4 Выделение и очистка химерного белка Альбурона.
3.4.1 Очистка Альбурона из среды ВММ
3.4.2 Очистка Альбурона из среды ВММ2.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ аппарат Гольджи
АДФ аденозин5 дифосфат
АК аминокислота, аминокислотный остаток
АКТГ аденокортикотропный гормон
АТ антитела
АТФ аденозин5трифосфат
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
ГАФ глицеральдегид3фосфат
ГДФ гуанозин5дифосфат
ГКГ главный комплекс гистосовместимости
ГМКСФ гранулоцитарномакрофальный колониестимулирующий фактор ГТФ гуанозин5трифосфат ДОА диоксиацетои ДТТ дитиотрейтол
ДЭАЭцеллюлоза диэтиламиноэтилцеллюлоза
ИЛ интерлейкин
ИПС изопропиловый спирт
ИФН интерферон
НАД никотинамидадениндинуклеотид, окисленная форма
НАДН никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтилен гликоль
ТХУ трихлоруксусная кислота
УДФ уридин5дифосфат
УФ ультрафиолетовое излучение
ФАД флавинадениндинуклеотид
ФНОа фактор некроза опухоли а
Фр фруктоза
ЦНС центральная нервная система ЭГТА этиленгликольтетрауксусная кислота ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ЭПР эндоплазматический ретикулум ЭФ электрофорез
бычий сывороточный альбумин
ЭПРассоциировангная деградация белков
фукоза
галактоза
глюкоза
ацетилглюкозамин
I гликозилфосфатидилинозитол
глутатион, восстановленная форма
глутатион, окисленная форма
поверхностный антиген вируса гепатита В
сывороточный альбумин человека
манноза
ацетилнейраминовая кислота
фенилметансульфонилфторид ингибитор сериновых протеаз
РОМС проопиомеланокортин
РТН паратиреоидный гормон
додецилсульфат натрия
трансформирующий фактор роста р
убиквитин
реакция несвернутых белков, i
липотроиин
меркаптоэтанол
меланоцитстимулирующий гормон
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В аминокислотной последовательности ИФНа выделяют два высококонсервативных структурных участка, соответствующих основным функциональным доменам. Первый участок с по АК ответственен за связь с клеточным рецептором. Молекула интерферонаальфа состоит из пяти аспиралей, имеет 2 дисульфидные связи и рис. Рис. Пространственная структура молекулы ИФНа2а . II. Активной формой интерферонаальфа является мономер Ершов, . Тем не менее, кристаллографический анализ белка показал, что некоторые виды ИФНа способны к димеризации за счет координационной связи через ион цинка. Образование связи происходит с участием остатков глутаминовых кислот и обеих молекул. Некоторые исследователи полагают, что подобная димеризация может происходить в норме в организме человека, а не только i vi, поскольку данный вид димеризации характерен для большинства молекул интерферонов i . В настоящее время известно, что интерфероны, как и другие цитокины, действуют подобно гормонам, связываясь с рецептором на поверхности клетки, они передают сигнал в ядро через сложную систему вторичных мессенджеров. Рецептор ИФНа I относится к первому классу семейства рецепторов цитокинов. Следует отметить, что I участвует в передаче сигнала и связывании как ИФНа, так и ИФНр. До сих пор остается неясным вопрос о том, каким образом определяется избирательность рецептора к своему лиганду. Известно, что рецептор состоит их двух основных цепей I и I2, не связанных друг с другом до взаимодействия с ИФН. I имеет молекулярную массу кДа, и состоит из трех доменов большой концевой экстраклеточный домен, короткий гидрофобный трансмембранный домен и внутриклеточный цитозольный домен, связаный с тирозинкиназой 2 i . Непосредственно с лигандом ИФНар контактирует последовательность из АК экстраклеточного домена i . Да и также состоит из трех доменов. Экстраклеточный домен I2 связывается с лигандом, а цитозольный домен с тирозинкиназой 1 vi . Ассоциация полнпетидов происходит только в присутствии лиганда . После объединения субъединиц рецептора происходит активация двух тирозинкиназ Тук2 и , связанных с цитозольными доменами I и I2 рис. Тирозинкиназы фосфорилируют друг друга, молекулу I2 и белки семейства i iv ii ii . Активация субъединицы I2 обеспечивает ее связывание с белками , а фосфорилированные белки в свою очередь обретают способность к гомо или гетеродимеризации. Гетеродимер транспортируется в ядро, где образует комплекс с регуляторным белком р или I3 Ii3. Комплекс I связывается с 1 i i последовательностями промоторов интерферониндуцибельных генов, ответственных за антивирусную и иммуномодулирующую активности. Рис. ИФНа3 i . Долгое время существовало мнение, что интерфероны непосредственно проникают в клетку, посредством везикулярного транспорта перемещаются внутри клетки, попадают в ядро и, связываясь с определенными последовательностями ДНК, активируют транскрипцию генов, кодирующих факторы, ответственные за антипролиферативную и антивирусную активности . Было показано, что ИФЫу в комплексе с субъединицей своего рецептора может проникать в ядро и выполнять роль транскрипционного фактора или коактиватора транскрипции, подобно гормонам роста, эпидермальным факторам роста и ИЛ5 i . В настоящий момент выделяют два основных молекулярных механизма, обеспечивающих интерферониндуцированную устойчивость к вирусным инфекциям. Вопервых, интерферон инициирует синтез ,олигоаденилатсинтазы ОАС. Данный фермент активируется двунитевой РНК и образует из АТФ или ГТФ адениловые или гуаниловые олигонуклеотиды, в которых мономеры связаны нетипичными а не связями. РНКазу от англ. РНК, которая является общей стадией жизненного цикла для многих вирусов . Вторым белком, ответственным за противовирусную активность ИФН, является протеинкиназа ПК. Механизм действия ГЖ состоит в фосфорилировании фактора инициации трансляции 2. Это приводит к его инактивации и невозможности осуществления синтеза белка , ii . Таким образом, наряду с подавлением синтеза белков клетки, подавляется и образование новых вирионов. Следует отметить, что, подобно ,ОАС, ПК также активируется двунитевой РНК.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.492, запросов: 157