Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов

Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов

Автор: Семихин, Александр Сергеевич

Шифр специальности: 03.02.03

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2010

Место защиты: Москва

Количество страниц: 171 с. ил.

Артикул: 4648616

Автор: Семихин, Александр Сергеевич

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Технология аффинных доменов и ее применение для получения химерных белков.
1.2. Аффинные домены
1.2.1. Целлюлозосвязывающие домены
1.2.2. Коллагенсвязывающие домены
1.2.2.2. Коллагенсвязывающие домены из фактора фон Виллебранда быка и человека уУРВ, уУРН и уУРН2.
1.2.2.3. Коллагенсвязывающий домен из остеонектина
человека СоНВИ.
1.2.2.4. Декстрансвязывающий домен из декстрансахаразы микроорганизма Ьеисопоьюс тезегНегосеБ.
1.3. Биологически активные белки
1.3.1. Эпидермальный фактор роста человека ЕР
1.3.2. Фактор роста фибробластов человека ЕСЕ.
1.3.3. Интерферон бета человека IРУУД
1.3.3.1. Интерферон бета и его функции.
1.3.3.2. Производство интерферона бета.
1.3.4. Костные морфогенетические белки человека ВМР.
1.3.4.1. Методы получения ВМР
1.3.4.2. Общая характеристика ВМР
1.3.4.3. Механизм действия ВМР.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.4. Материалы и реактивы.
2.4.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды.
2.4.2. Бактериальные штаммы и линии клеток.
2.4.3. Лабораторные животные.
2.4.4. Питательные среды.
2.4.5. Ферменты
2.4.6. Сорбенты
2.4.7. Буферные растворы.
2.4.8. Другие реактивы.
2.4.9. Оборудование
2.5. Основные методики.
2.5.1. Полимеразная цепная реакция.
2.5.2. Химикоферментативный синтез
2.5.3. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами
2.5.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.5.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.
2.5.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.5.7. Выделение и очистка аналитического количества.
плазмидной ДНК.
2.5.8. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК
2.5.9. Выделение хромосомной ДНК и.
i
2.5 Определение нуклеотидных последовательностей.
плазмидных ДНК.
2.5 Подготовка компетентных клеток Е. i для трансформации плазмидной ДНК электропорацией
2.5 Трансформация клеток Е. i.
2.5 Электрофорез белков в Г1ААГДСН
2.5 Выращивание штаммапродуцента и индукция синтеза
рекомбинантных белков
2.5 Определение растворимости белков
2.5 Выделение и очистка рекомбинантных белков на целлюлозе,.
с помощью целлюлозосвязывающего домена
2.5 Выделение и очистка рекомбинантных белков на сефадексе,
с помощью декстрансвязывающего домена
2.5 Выделение и очистка белков, содержащих
коллагенсвязывающие домены.
2.5 Измерение биологической активности интерферона бета.
2.5 Измерение активности щелочной фосфатазы.
2.5 Получение телец включения . i, содержащих ВМР
2.5 Очистка рекомбинатного 2 и получение биологически
активной формы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание бактериальных штаммовпродуцентов аффинных доменов.
3.1.1. Создание бактериального штаммапродуцента коллагенсвязывающего домена
3.1.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка .
3.1.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка в клетках . i штаммов М и
3.1.2. Создание бактериальных штаммовпродуцентов белков v,
v и v2.
3.1.2.1. Клонирование нуклеотидных последовательностей генов белков v, v, v
3.1.2.2. Экспрессия рекомбинантных генов белков v, v2, v в клетках . i
3.1.3. Создание бактериального штаммапродуцента белка .
3.1.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка В
3.1.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка II клетках
. i5.
3.1.4. Создание бактериального штаммапродуцента декстрансвязывающего домена .
3.1.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка
3.1.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка в клетках
Е. i 5
3.2. Изучение аффинных свойств полученных доменов.
3.3. Создание бактериальных штаммовпродуцентов биологически активных белков.
3.3.1. Создание бактериального штаммапродуцента белка
3.3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
бечка .
3.3.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка в клетках
. i 5.
3.3.2. Создание бактериального штаммапродуцента белка
3.3.2.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка
3.3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка в клетках
Е. i
3.3.3. Создание бактериального штаммапродуцента белка I.
3.3.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка I.
3.3.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка I
в клетках Е. i 5.
3.3.4. Создание бактериального штаммапродуцента белка ВМР
3.3.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена
белка ВМР
3.3.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка ВМР2 в клетках
Е. i 5.
3.4. Создание бактериальных штаммовi дюдуцентов химерных белков, несущих в своем составе аффинные домены и биологически активные белки
3.4.1. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка vi.
3.4.1.1. Клонирование гена химерного белка v.
3.4.1.2. Экспрессия гена химерного белка v в клетках
Е. i 5.
3.4.2. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка v.
3.4.2.1. Клонирование гена химерного белка v
3.4.2.2. Экспрессия гена химерного белка vi в клетках
Е. i 5.
3.4.3. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка
3.4.3. 1. Клонирование гена химерного белка
3.4.3.2. Экспрессия гена химерного белка в клетках
Е. i 5.
3.4.4. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка
3.4.4.1. Клонирование гена химерного белка
3.4.4.2. Экспрессия гена химерного белка в клетках
Е. iI
3.4.5. Получение спейсерной последовательности и
конструкции .
3.4.6. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка
3.4.6.1. Клонирование гена химерного белка
3.4.6.2. Экспрессия гена химерного белка в клетках
. i М
3.4.7. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка
3.4.7.1. Клонирование гена химерного белка
3.4.7.2. Экспрессия гена химерного белка в клетках
. i М
3.4.8. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка I.
3.4.8.1. Клонирование гена химерного белка I.
3.4.8.2. Экспрессия гена химерного белка I в клетках
. i М
3.4.9. Создание бактериального штаммапродуцента химерного
белка
3.4.9.1. Клонирование гена химерного белка
3.4.9.2. Экспрессия гена химерного белка 2 в клетках
. i М
3.4.9.3. Подбор и оптимизация условий, способствующих восстановлению биологически активной формы ВМР2.
3.5. Оптимизация условий культивирования бактериальных клеток,
СОДЕРЖАЩИХ ГЕНЫ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ.
3.5.1. Подбор условий культивирования штаммовпродуцентов рекомбинантных белкоа в колбах
3.5.2. Наработка биомассы в ферментере i Вi 5. .
3.6. Исследование биологических свойств химерного белка
НА МОДЕЛИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ клеток i vi ПОВЕРХНОСТИ ПЛАШЕК, ПОКРЫТЫХ КОЛЛАГЕНОМ.
3.7. Исследование биологических свойств химерного белка на модели культивирования эукариотических клеток i vi в
ОБЪЕМЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
3.8. Исследование биологической активности химерного белка
I I VI, НА МОДЕЛИ ИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА МЫШЕЙ.
3.9. Исследование биологической активности химерного белка 2 i VI, НА КУЛЬТУРЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ клеток
3 Исследование биологической активности химерного белка 2 i viv, на модели костного дефекта в большеберцовой кости крыс
3 Исследование биологической активности химерного белка 2 i viv, на модели костного дефекта в черепе крыс
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
i i костный морфогенетический белок человека,
ii i целлюлозосвязывающий домен,
ii i коллагенсвязывающий домен из остеонектина человека,
xii i декстрансвязывающий домен,
i эпидермальный фактор роста человека,
i фактор роста фибробластов человека,
i глутатионБтрансфераза,
I i интерферон человека,
МБР ii i мальтозосвязывающий белок,
МНС iiii x главный комплекс гистосовместимости, р i плазмида,
i фосфатный буфер,
коллагенсвязывающий домен из адгезина , спейсерная последовательность,
Тяполимераза ДНК полимераза микроорганизма i,
i трансформирующие ростовые факторы, v v i коллагенсвязывающий декапептид из фактора фон Виллебранда быка человека,
а.о. аминокислотный остаток,
БСА бычий сывороточный альбумин,
ДКМ деминерализованный костный матрикс,
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота, дНТФ дезоксирибонуклеозидтрифосфаты,
ДСН додецилсульфат натрия,
ИПТГ изопропил 1тиор0галактопиранозид,
кДа килодальтон,
ЛД летальная доза,
МСК мезенхимальные стволовые клетки,
ОП оптическое поглощение,
и.н. пара нуклеотидов,
ПААГ полиакриламидный гель,
ПНР полимеразная цепная реакция,
Трис трисгидроксиметиламинометан, цАМФ циклический аденозинмонофосфат,
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота.
Для обозначения аминокислотных остатков, нуклеотидов, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии 1ЦРАС и Международного союза биохимиков ШВ.
6В ЕДЕ НИЕ
Актуальность


Такие покрытия показали свою эффективность в клинике благодаря их использованию повреждения кожи заживают путем первичного натяжения без образования рубцов и скорость полного восстановления ткани сокращается в раза. Также рекомбинантные ростовые факторы могут применяться для улучшения существующих и разработки новых систем культивирования эукариотических клеток. Для этих целей используются эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов, т. Препараты рекомбинантного интерферона бета в настоящее время применяются в медицине для лечения широкого спектра патологий это, прежде всего, различные вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания и злокачественные опухоли. Однако, несмотря на очевидную эффективность препаратов на основе интерферона, существующие технологии получения этого белка не способны в полной мере удовлетворить растущие потребности медицины. В свою очередь рекомбинантный интерферон, синтезированный в бактериальных клетках может быть загрязнен различными токсичными белками и пирогенами, и также токсичен для клетокпродуцентов. Ежегодно в России регистрируется около млн. Одним из наиболее эффективных методов лечения является заполнение дефектов кости различными биокомпозитами, ускоряющими рост костной ткани. В ряде случаев необходимо использование металлоконструкций для обеспечения фиксации кости в месте перелома. Для улучшения приживаемости таких имплантатов их также покрывают композиционными покрытиями. Однако не все материалы достаточно биосовеместимы и актуальной проблемой трансплантологии сейчас является создание новых поколений биодеградируемых и биосовместимых покрытий и матриксов, в которые введены биологически активные соединения, обеспечивающие благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей. Новое поколение композиционных препаратов кроме широко используемых материалов коллагена и гидроксиапатита содержит биологически активные белки факторы роста. Одним из основных таких белков является костный морфогенетический белок 2 i i 2 ВМР2. Функции 2 в организме чрезвычайно разнообразны, но основная его задача во взрослом организме поддержание и восстановление костной ткани. Введение в состав композиционных препаратов рекомбинантного ВМР2 способно сократить время заживления переломов в раза, а при обработке металлических имплантатов биосовместимыми покрытиями, содержащими ВМР2, снизить вероятность отторжения имплантатов в раз. Цель и задачи исследования. Часть работы, связанная с получением рекомбинантного белка ВМР2 и композиционных препаратов на его основе, выполнялась в рамках государственного контракта . Клонирование в клетках Е. Виллебранда быка v и человека v и v2, коллагенсвязывающий домен из остеонектииа человека , декстрансвязывающий домен из декстрансахаразы микроорганизма i . I и костный морфогенетический белок человека 2 ВМР2. Выбор оптимальных аффинных доменов для создания химерных конструкций с биологически активными белками. Создание штаммов Е. Оптимизация условий культивирования штаммовпродуцентов химерных белков , , I и 2. Отработка методов очистки и иммобилизации химерных белков , , I и 2 на соответствующих сорбентах желатинсефарозе для белков, несущих в своем составе коллагенсвязывающий домен и Сефадексе для белков, содержащих декстрансвязывающий домен. Разработка методики оценки биологической активности препаратов химерных белков и при культивировании эукариотических клеток i vi. Изучение биологической активности препарата белка I иммобилизованного на Сефадексе i vi. Изучение биологической активности препарата белка 2 i vi. Разработка методик изучения и оценки биологической активности препаратов, содержащих рекомбинантный белок 2 i viv. Научная новизна. Были достигнуты высокие уровни продукции химерных белков и созданы высокоэффективные системы выделения, очистки и иммобилизации их на соответствующих сорбентах, основанные на способности выбранных аффинных доменов специфически связываться с соответсвующим сорбентом. Степень чистоты полученных таким образом белковых препаратов составила более .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.215, запросов: 165