Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX

Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX

Автор: Рогожин, Василий Николаевич

Шифр специальности: 03.01.06

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2011

Место защиты: Москва

Количество страниц: 168 с. ил.

Артикул: 5384243

Автор: Рогожин, Василий Николаевич

Стоимость: 250 руб.

Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX  Создание новых векторных систем на основе рекомбинантного аденовируса человека с генетически модифицированным капсидным белком IX 

ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика аденовирусов.
1.1.1. Классификация аденовирусов.
1.1.2. Строение и репродукция аденовирусов
1.2. Векторы на основе аденовирусов человека ссротипа
1.3. Методы конструирования капсидмоднфицированных адсиовекгоров
1.3.1. Аденовирусные векторы с модифицированными фибсрами.
1.3.2. Аденовирусные векторы с модифицированными гексонами
1.3.3. Аденовирусные векторы с модифицированными белками 1а.
1.3.4. Аденовирусные векторы с модифицированными белками IX.
1.3.4.1. Особенности строения, экспрессии и локализации белка IX.
1.3.4.2. Стратегия генетической модификации белка IX.
1.3.4.3. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 с модифицированным р1Х и возможные пути применения его модификации
1.4. Углеводсвязывающие домены гликозилгидролаз и их практическое применение.
1.5. Наноантитсла и их применение в качестве агентов для связывания с опухолеспецифическими рецепторами
1.5.1. Структурные и биофизические особенности наноантител
1.5.2. Применение наноантитсл для связывания с опухолеспецифическими рецепторами
1.6. Перспективы применения модификации р1Х аденовируса углеводсвязывающими доменами гликозилгидролаз и наноантнтелами
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы.
2.1.4. Ферменты и другие реактивы.
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. Методы
2.2.1. Подготовка компетентных клеток . i штамма II
2.2.2. Подготовка компетентных клеток . i штамма .
2.2.3. Трансформация компетентных клеток . i штамма 5.
2.2.4. Трансформация компетентных клеток . i штамма
2.2.5. Гомологичная рекомбинация в клетках . i
2.2.6. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.
2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.8. Метод рестрикционного картирования ДНК с помощью специфических эндодезоксирибонуклсаз
2.2.9. Дефосфоршшрование5концов плазмидноговектора.
2.2 Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2 Препаративное разделение фрагментов ДНК с помощью гельэлсктрофореза и их элюирование из агарозного геля.
2.2 Лигирование фрагментов ДНК
2.2 Идентификация рекомбинантных клонов.
2.2 Полимеразная цепная реакция.
2.2 Выделение тотальной ДНК.
2.2 Трансфекция культур клеток методом липофекции.
2.2 Получение рекомбинантных аденовирусов.
2.2 Накопление вирусов
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов.
2.2 Выделение вирусной ДНК
2.2 Титрование рекомбинантных аденовирусов
2.2 Иммунизация животных
2.2 Приготовление сыворотки.
2.2 Иммуноферментный анализ для доказательства экспонирования углеводсвязывающих доменов над поверхностью капсидов р1Хмодифицированных аденовирусов
2.2 Иммуноферментный анализ для доказательства специфического взаимодействия лейциновых зипперов в составе р1Х аденовируса и в молекулах рекомбинантных наноантител.
2.2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.2 Электрофорез белков в ПЛАГДСН РЛ0Е8.
2.2 Оценка термостабильиости рекомбинантных аденовирусов
2.2 Определение углеводсвязываюгцей способности рекомбинантных аденовирусных векторов с углеводсвязывающими доменами в составе капсидного белка IX
2.2 Проточная цитофлуориметрия
2.2 Электронная микроскопия.
2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ.
2.2 Статистическая обработка результатов исследований.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5, экспонирующих на поверхности капсида целлюлозосвязывающие и декстрансвязывающие домены в составе белка IX
3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих последовательности целлюлозосвязывающего СЕЮ или декстрансвязывающего ОЕЮ доменов на Сконце капсидного белка IX Ад5.
3.1.2. Получение плазмидных конструкций, содержащих полноразмерный геном Ад5 и несущих последовательности ЭЕЮ или СВО на Сконце р1Х
3.1.3. Получение рекомбинантных Ад5 с декстраисвязывающими или цсллюлозосвязывающими доменами в структуре р1Х
3.1.4. Изучение физической стабильности рекомбинантных Ад5 с декстрансвязывающими или целлюлозосвязывающими доменами в струкгуре р1Х
3.2. Определение функциональной активности углсводсвязывающих доменов, находящихся в структуре капсидного белка рХ рекомбинантных аденовирусов
3.2.1. Доказательство экспонирования углеводсвязывающих доменов над поверхностью капсида рекомбинантных аденовирусов
3.2.2. Определение способности р1Хмодифицированных аденовскгоров с углеводсвязывающими доменами связываться с соответствующими полисахаридными субстратами.
3.3. Подбор условий элюирования модифицированного аденовируса с целлюлозосвязывающими доменами, адсорбированного на аморфной целлюлозе
3.3.1. Выбор метода десорбции аденовируса с СВО, связанного с волокнами аморфной целлюлозы.
3.3.2. Подбор условий элюирования модифицированного аденовируса с целлюлозосвязывающими доменами, адсорбированного на аморфной целлюлозе, с помощью кислых буферов
3.4. Очистка р1Хмодифицироваиного аденовируса с целлюлозосвязывающими доменами в препаративных количествах из культурального препарата с помощью аморфной целлюлозы.
3.5. Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5, экспонирующих на поверхности капсида последовательности лейциновых зипперов в составе белка IX
3.5.1. Получение плазмидной конструкции, содержащей полноразмерный геном Ад5 и несущей последовательность ЕЯзиппсра на Сконцс р1Х Лд5.
3.5.2. Получение рекомбинантного Ад5, содержащего ЕЯзипперы в структуре р1Х и несущего репортсриый ген ЕвРР
3.6. Определение способности аденовирусного вектора с ЕЯлейциновыми зипперами специфически адсорбировать на своей поверхности рекомбинантные антиСЕАнаноантитела
3.7. Определение эффективности доставки генетической информации аденовекторами с лейциновыми зипперами, нагруженными наноантителами против опухолсспсцифического рецептора СЕА, в опухолевые клетки САЯнезависимым путем.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
3НЕК линия клеток почки эмбриона человека, трансформированных Е1областыо генома Ад
а.о. аминокислотный остаток Ад аденовирус
Ад5 аденовирус человека серотипа 5 АТ антитело
БОЕ бляшкообразующая единица ВИЧ вирус иммунодефицита человека Да дальтон
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ дезоксирибонуклеозидтрифосфат ДСН додецилсульфат натрия ИФА иммуноферментный анализ кДа килодальтон
МАА меланомаассоциированный антиген
ОФЭКТ однофотонная эмиссионная компьютерная томография
п.н. пара нуклеотидов
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
РНК рибонуклеиновая кислота
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ТР терминальный белок
УСД углеводсвязывающие домены
ЦПД цитопатическое действие
ЦСД целлюлозосвязывающий домен
А9 клетки карциномы легких человека
2,2ацидобис3этилбензотиазолин6сульфоновая кислота диаммонисвая соль
ВАР биотинсвязывающий пептид
ферментный комплекс карбамилфосфатсинтетаза,
аспартаттранскарбамилаза и дигидрооротаза
коксакивирусныйаденовирусный рецептор
целлюлозосвязывающий домен i
кластер дифференцировки
гипервариабельные участки антитела
СЕА карциноэмбриональный антиген
V промотор цитомегаловируса человека
декстрансвязывающий домен i
диэтиламиноэтил
зеленый флуоресцирующий белок
рецептор эпидермального фактора роста
I флуоресцеинизотиоцианат
надлежащая лабораторная практика
надлежащая производственная практика
группа из девяти гексонов аденовируса
главный комплекс гистосовместимости человека
гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин К
V1 вирус простого герпеса
V гипервариабельный регион
IV Международный комитет по таксономии вирусов
иммуноглобулин
I концевые повторяющиеся последовательности
i5 клетки карциномы толстого кишечника человека
1 муциноподобный антиген
открытая рамка считывания
фосфатный солевой буфер
водородный показатель
р1Х минорный капсидный белок аденовирусов человека
полифосфатглюкокиназа
простатический специфический антиген
красный флуоресцирующий белок
трипептид аргинилглициласпарагиновая кислота
однодоменное антитело
Тклеточный рецептор
V вителлогенинсвязывающий белок
V вариабельный домен тяжелой цепи антитела
V вариабельный домен легкой цепи антитела
V3 рецептор для фибронектина, коллагена и ламинина
i последовательность лейциновой молнии транскрипционного
фактора V
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ


Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX целлюлозосвязывающие и декстрансвязывающие домены. Доказано, что углеводсвязывающие домены экспонированы над поверхностью капсидов полученных рекомбинантных аденовирусов, а для аденовируса с целлюлозосвязывающими доменами в составе р1Х впервые показана способность специфически связываться с волокнами аморфной целлюлозы. Разработан новый способ аффинной очистки рХмодифицированньх аденовирусных векторных систем с целлюлозосвязывающими доменами на целлюлозном носителе. Показана высокая эффективность нового способа очистки аденовекторов в получении чистого, биологически активного препарата аденовируса. Впервые получены рекомбинантные аденовирусы человека серотипа 5, несущие в составе капсидного белка IX последовательность лейцинового зиппера. На моделях культур клеток аденокарциномы легких человека линия А9 и карциномы толстой кишки человека линия i5 показано, что рекомбинантный аденовирусный вектор, содержащий репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка , с лейциновыми зипперами в составе белка IX, нагруженный наноантителами против опухолеспецифического рецептора СЕА, способен к эффективному проникновению в опухолевые клетки человека независимым путем. Федерации от Способ очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы от года. Плазмидная технология модификации гена капсидного белка IX аденовируса человека серотипа 5 внедрена в работу лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России для получения рекомбинантных аденовирусов с различными модификациями белка IX. Коллекция полученных рекомбинантных аденовирусов АсЕСРРр1ХСВО, АсЕОРРр1ХОВО и Аб5ЕОРРр1Хррег хранится в вирусном музее лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. По результатам научноисследовательской работы разработаны Методические положения по использованию аффинной очистки в производстве рекомбинантных аденовирусных векторов с генетически модифицированным капсидным белком IX, утвержденные на заседании секции отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук Ветеринарная биотехнология протокол 2 от октября г. Разработанный способ аффинной очистки векторных систем на основе р1Хмодифицированных рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5 используется в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России для очистки препаративных количеств рекомбинантных аденовирусных векторов. Автор непосредственно получил рекомбинантные аденовирусные вектора с модифицированным р1Х, разработал и оптимизировал технологию очистки р1Хмодифицированных аденовирусных векторов, исследовал проникающую способность модифицированного аденовектора с лейциновым зиппером в составе р1Х в опухолевые клетки человека, проанализировал, обобщил и интерпретировал полученные результаты, сформулировал выводы и рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии очистки и полученных аденовекторов. Электронная микроскопия образцов аденовирусов была выполнена совместно с д. Диденко Л. В., а цитофлуориметрия клеточного материала совместно с к. Щебляковым Д. В. ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. Результаты диссертационной работы были доложены на итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за и годы в рамках приоритетного направления Живые системы ФЦП Исследования и разработка научнотехнического комплекса России на гг. Москва, , , Международной научнопрактической конференции Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии Москва, , V Московском международном конгрессе Биотехнология состояние и перспективы развития Москва, , IX Международном аденовирусном съезде Венгрия, Добогоко, . Автор является победителем Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых ВУЗов Минсельхоза РФ по направлению Биологические науки МоскваБрянскКраснодар, .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.180, запросов: 160