Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов

Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов

Автор: Печенкин, Михаил Александрович

Шифр специальности: 03.01.06

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 2012

Место защиты: Москва

Количество страниц: 158 с. ил.

Артикул: 6523172

Автор: Печенкин, Михаил Александрович

Стоимость: 250 руб.

Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов  Мультифункциональные полиэлектролитные микрочастицы для пероральной доставки рекомбинантных инсулинов 

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Глава 1. Инсулин. Общие сведения.
1.1. Структура и физикохимические свойства
1.2. Биологическая активность инсулина.
1.3. Биосинтез и регуляция секреции инсулина.
1.4. Механизм действия инсулина.
Глава 2. Способы доставки инсулина
2.1. Традиционные методы введения инсулина
2.2. Альтернативные методы введения инсулина
2.2.1. Доставка через слизистую ротовой полости.
2.2.2. Пульмонарная доставка
2.2.3. азалышя доставка.
2.2.4. Трансдермальная доставка.
2.2.5. Окулярная доставка.
Глава 3. Пероральиая доставка инсулина
3.1. Полиэлектролитные системы доставки.
3.2. Защита инсулина от протеолиза
3.2.1. Действие носителя
3.2.2. Ингибиторы протсолитических ферментов
3.2.2.1. Небелковые ингибиторы
3.2.2.2. Белковые ингибиторы
3.3. Транспорт инсулина через эпителий кишечника
3.3.1. Мукоадгезия
3.3.2. Захват Мклеткам и.
3.3.3. Трансцеллюлярный путь
3.3.4. Парацеллюлярный путь.
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 4. Материалы и методы.
4.1. Материалы и реактивы.
4.2. Оборудование.
4.3. Методы исследования
4.3.1. Получение микрочастиц с использованием альгината и хитозана
4.3.2. Получение микрочастиц с использованием дскстрансульфата и хитозана.
4.3.2.1. Турбидиметрическое титрование инсулина декстрансульфатом
4.3.2.2. Получение микроагрегатов комплекса инсулиндекстрансульфат
4.3.2.3. Постадийная адсорбция полиэлектролитов
4.3.3. Включение ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы
4.3.3.1. Включение на стадии образования комплекса бслокдскстрансульфат
4.3.3.2. Включение на стадии сорбции поликатиона.
4.3.4. Характеристика полнэлектролитных микрочастиц
4.3.4.1. Растровая электронная микроскопия.
4.3.4.2. Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия.
4.3.4.3. Оптическая микроскопия
4.3.4.4. Определение потенциала микрочастиц
4.3.4.5. Определение белка.
4.3.4.6. Определение дскстрансульфата
4.3.4.7. Определение хитозана
4.3.4.8. Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием
трипсина.
4.3.4.9. Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием
химотрипсина.
4.3.4 Определение содержания активного овомукоида
4.3.5. Высвобождение белков и декстрансульфата из микрочастиц
4.3.5.1. рНзависнмое высвобождение
4.3.5.2. Кинетика высвобождения инсулина в модельных средах
4.3.6. Определение формы высвобождения белков из микрочастиц.
4.3.6.1. Гельхроматография
4.3.6.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
4.3.7. Изучение факторов, влияющих на активность протеаз.
4.3.7.1. Влияние Са2, ЭДТА и декстрансульфата.
4.3.7.2. Влияние микрочастиц.
4.3.8. Изучение протеолитической деградации инсулина.
4.3.8.1. Определение активности трипсина.
4.3.8.2. Определение активности ахимотрнпсииа.
4.3.8.3. Деградация белка в модельных средах.
4.3.8.4. Анализ количества недеградированного белка
4.3.9. Определение связывания микрочастицами ионов кальция.
4.3 Определение связывания микрочастицами муцина.
4.3 Изучение действия микрокапсулированного инсулина i viv.
4 Определение содержания глюкозы в плазме крови
4 Определение содержания инсулина в плазме крови.
4 Изучение на здоровых кроликах
4 Изучение на крысах с диабетом
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Разработка методов анализа полнэлсктролитиых микрочастиц
5.1. Определение хитозана при наличии белка и полианионов в смеси
5.2. Определение активности протеаз при наличии полиэлектролитов в смеси.
Глава 6. Инсулинсодержащие полиэлектролптнме микрочастицы
6.1. Исследование микрочастиц из альгината и хитозана
6.1.1. Получение микрочастиц из альгината и хитозана.
6.1.2. Высвобождение белка из альгинатхитозановых микрочастиц.
6.2. Исследование микрочастиц из дскстрансульфата и хитозана.
6.2.1. Получение микрочастиц из декстрансульфата и хитозана с инсулином человека
6.2.2. Включение быстродействующих аналогов инсулина
6.2.3. Включение ингибиторов протеаз
6.2.4. Высвобождение белка и декстрансульфата из полиэлектролитных микрочастиц.
6.2.5. Исследование формы высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц.
6.2.6. Мукоадгезивные свойства полиэлектролитных микрочастиц
6.2.7. Са2связывающая способность полиэлектролитных микрочастиц.
6.2.8. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц от протсолнтических ферментов.
Глава 7. Исследование биологического действия микрокапсулированного инсулина
7.1. Исследование сохранения активности инсулина
7.2. Исследование гнпогликемического действия инсулина при пероральном введении здоровым кроликам.
7.3. Исследование фармакологического действия инсулина при пероральном введении крысам с диабетом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
в число стадий адсорбции полиэлсктролитов Алгальгинат натрия средней степени вязкости Апр апротинии из легких быка АЦЦ МацетилЬцистеин
БАПНА ЫбснзоилБаргинина паранитроанилид БАЭЭ ЫбензоилЬаргинина этиловый эфир БСА бычий сывороточный альбумин БТПНА МбснзоилЬтнрозина паранитроанилид БТЭЭ ЫбензоилБтирозина этиловый эфир ДС дскстрансульфат натрия, 0 кДа ЖКТ желудочнокишечный тракт
ИББ ингибитор трипсина и хим отри псина из сои типа БауманаБирк Инс рекомбинантный инсулин человека ИП ингибитор протеаз
ИТК ингибитор трипсина из сои типа Кунитца
нНЭК нерастворимый полиэлектролитный комплекс
Овм овомукоид из утиных яиц
оФА ортофталевый альдегид
ПАБ поверхностно активные вещества
ПКК плотные контакты клеток эпителия
Трип трипсин из поджелудочной железы быка
ТРИС трисгидроксиметилметиламин
ТФУ трифторуксусная кислота
Хим ахимотрипсин из поджелудочной железы быка
Хит хитозан, 0 кДа, степень деацетилирования
экстракт ИББИТК белковый экстракт из сои, обогащенный ингибиторами трипсина и химотрипсина типа БауманаБирк и трипсина типа Кунитца
ВВЕДЕНИЕ


Образование интсрмсдиата1 происходит при отщеплении двух аминокислот Ьу и Аг от Лцепи, а интермедиата при отщеплении Аг и А от Вцспи. С помощью карбокенпептидазы Е происходит полное отщепление двух соответствующих аминокислот и , в результате чего образуются Спсптид и инсулин 2. У человека образование инсулина из проинсулнна в основном происходит через формирование интермедиата1. Активность эндопептидаз и экспрессия соответствующих генов в рклетках регулируются количеством проинсулина в гранулах, а синтез последнего регулируется глюкозой на трансляционном и посттрансляцнонно. На основании проведенных исследований Vi В. В созревшей грануле инсулин находится в кристаллической форме, тогда как Спептид в растворимом состоянии. При нормальном состоянии организма количество инсулина в рклетках поддерживается на постоянном уровне точным балансом его секреции, биосинтезом из проинсулина и внутриклеточной деградацией инсулина. В случае, когда потребность в инсулине увеличивается, скорость его деградации снижается, и эта регуляция осуществляется по принципу обратной связи. Период полужизни секреторной гранулы составляет несколько дней, и если за этот период не происходит экзоцитоза, то инсулин деградируется в лизосомах внутри рклетки. Находящиеся в секреторной грануле белки различаются биологической активностью и длительностью существования. Так, период полураспада инсулина составляет 3 мин, Спептида около мин, проинсулина мин 2. Секреция инсулина происходит посредством экзоцитоза. В физиологической регуляции синтеза инсулина доминирующую роль играет концентрация глюкозы в крови. Так, повышение содержания глюкозы в крови вызывает увеличение секреции инсулина в панкреатических островках, а снижение ее содержания наоборот, замедление секреции инсулина. Контроль по типу обратной связи рассматривается как один из важнейших механизмов регуляции содержания глюкозы в крови, рклетки чувствительны даже к незначительным ее изменениям. Увеличение скорости секреции инсулина наблюдается при концентрациях внутриклеточной глюкозы между 5,5 и мМ, причем максимальная стимуляция секреции инсулина имеет место при содержании глюкозы около 8 мМ. Необходимо отметить, что глюкоза, поступающая в кровь из желудочнокишечного тракта ЖКТ, способствует более значительному высвобождению инсулина из рклеток поджелудочной железы и, естественно, более высокому уровню инсулина в сыворотке крови по сравнению с тем же количеством глюкозы, но введенной внутривенно. Такая разница в стимуляции высвобождения инсулина в ответ на одинаковое количество глюкозы объясняется тем, что поступившая в ЖКТ глюкоза стимулирует секрецию инсулина не только повышенным ее уровнем в крови, но и посредством активации механизма, включающего секрецию ряда гормонов ЖКТ гастрина, секретина, холсцистокинипа, глюкагона, желудочного ингибиторного полипептида или глюкозозависимого инсулинотропного пептида 9. Свое биологическое действие на уровне клетки инсулин осуществляет через соответствующий инсулиновый рецептор. Он представляет собой тетрамерную белковую структуру, являющуюся составной частью мембраны клетки. Рецептор включает две субъединицы, каждая из которых также состоит из двух частей. Полипсптидмая цепь асубъединицы состоит из 9 аминокислотных остатков, рсубъединица включает 0 аминокислотных остатков. Две асубъединицы и две Рсубъединицы ковалентно связаны дисульфидным мостиком рис. Количество рецепторов инсулина на клетке зависит от тканимишени. Так, эритроцит, находящийся в центральном кровообращении, содержит около инсулиновых рецепторов, тогда как гспатоциты более 0 0 на клетку 2. Субъсдиница располагается внеклеточно и содержит два специфических сайта для связывания инсулина, тогда как Рсубъединица условно состоит из трех частей незначительной длины внеклеточной части, трансмембранного домена и внутриклеточной инсулинрегулируемой белковой тирозинкиназной активности. Трансмембранный домен рецептора к инсулину стабилизирует тс конформационные изменения, которые возникают после взаимодействия асубъединицы с рецептором. Между субъединицами существуют дополнительные С0 и СЫ связи через боковые цепи.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.249, запросов: 160