Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов

Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов

Автор: Спиридонова, Вера Алексеевна

Шифр специальности: 03.01.02

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2011

Место защиты: Москва

Количество страниц: 246 с. ил.

Артикул: 5087403

Автор: Спиридонова, Вера Алексеевна

Стоимость: 250 руб.

Введение
1. Обзор литературы.
1.1. Метод X
1.1.2. У короченные аптамеры
1.1.3. Сравнение свойств антител с аптамерами.
1.2. Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях.
1.3. Аптамеры к антибиотикам
1.3.1. Аптамеры к тетрациклину.
1.3.2. Аптамеры к стрептомицину
1.3.3. Аптамеры к хлорамфениколу.
1.3.4 Аптамеры к аминогликозидам
1.4. Аптамеры как биосенсоры
1.5.Свойства аптамеров, ингибирующих биологическую активность белков
1.6. Аптамеры к белкам, не связывающим нуклеиновые кислоты
1.6.1. Аптамеры к тромбину4
1.6.2. Аптамеры к фактору Vi.
1.6.3. Ап тамеры к фактору 1Ха.
1.6.4. Аптамеры к протеиназе вируса гепатита С 3 V3.
1.6.5. Аптамеры к эластазе нейтрофилов человека
1.6.6. Аптамеры к V.
1.6.7. Аптамеры к основному ростовому фактору фибробластов.
1.6.8. Аптамеры к ростовому фактору .
1.6.9. Аптамеры к интерферону у человека.
1.6 Аптамеры к ангиопоэтину2.
1.6 Аптамеры к белкам вируса гриппа.
1.7. Аптамеры к белкам, связывающим нуклеиновые кислоты.
1.7.1. Аптамсры к белку.
1.7.2. Аптамеры к IV v ревертаза.
1.7.3. Аптамеры к IV обратной транскриптазе
1.7.4. Транскрипционный фактор
1.7.5 Аптамеры к фактору
1.8. Аптамеры к антителам, к иммуноглобулинам.
1.8.1. Аптамеры к антителу МА к инсулиновому рецептору
1.8.2.Аптамеры к моноклональному антителу к ацетилхолиновому рецептору
1.8.3.Аптамеры к иммуноглобулину Е
1.8.4.Аптамеры к цитотоксичному антисну Т
1.9.Аптамеры к адгезивным молекулам.
1.9.1 .Аптамеры к РСелектину.
1.9.2.Аптамеры к селектину
1Аптамеры к антигену .
1Аптамеры к белкам комплемента С5 человека
1Аптамеры к линопротеинам непанкреатическая секреторная фосфолипаза А2 человека
1Аптамеры к прионовым белкам РгР
1Аптамеры к патогенам к трипанозоме.
2. Результаты и обсуждение
2.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка 7 с рРНК
в составе , компьютерное моделирование третичной структуры белка
2.2. Изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком
7 прокариот
2.2.2. Создание суперпродуцентов рибосомных белков 7 из различных организмов ii i 7, i 7. Отработка методов сворачивания белковой молекулы
2.2.3. Изучение комплсксообразопание рибосомных белков 7 из ii i 7 и i 7 с фрагментами . i и делеционными фрагментами мРНК . i
2.2.3.1. Взаимодействие фрагмента 6 рРПК с белками 7,
2.2.3.2. Изучение влияния белков 7 и 7 на структуру фрагмента 6 II
2.2.3.3. Взаимодействие фрагмента мРНК с белками 7 и 7.
2.2.3.4. Изучение влияния белков 7 и 7 на структуру фрагмента
мРНК
2.2.4. Делеционный анализ мРНК . i.
2.2.5. Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона мРНК
. i с белками 7 и 7.
2.2.6. Селекция антамеров РНК на основе фрагмента мРНК.
2.2. Создание аптамерных ДНК к тромбину, обладающих стабильной
пространственной спруктурой и снособносгью связывать фомбин с высокой эффективностью и специфичностью i vi. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях i vi.
2.2.1. Создание ДНКаптамсров к тромбину
2.2.2. Компьютерное моделирование струкгур ДНКаптамеров
2.2.3. Изучение ДКаптамеров методом кругового дихроизма
2.2.4. Комплексы ДНКаптамеров с тромбином
2.2.5. Изучение взаимодействия аптамера с тромбином методом плазмонного резонанса ППР.
2.2.6. Тромбин ключевой белок свертывания крови
2.2.7. Ингибирование процессов свертывания крови ДНКаптамерами
2.2.8. Влияние мутантного аптамсра на процесс свертывания крови
2.2.9. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов
2.3.Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка
эффективности ингибирующее действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели i viv
2.3.1. Свойства модифицированных аптамеров.
2.3.2. Действие модифицированных аптамеров на тромбин
индуцированную агрегацию тромбоцитов.
2.3.3.Изучение влияния ДНКаптамеров на коагуляционную способность плазмы крови на животных моделях
2.3.4. Оценка ингибирующего действия модифицированных аптамеров на модели артериального тромбоза i viv
2.4. Создание антидота к аптамерной ДИК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в
нуклсопротсидном комплексе антамертромбин.
2.4.1. Структура антидота
2.4.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамертромбин
3. Материалы и методы
3.1. Программы и схемы, использованные при компьютерном моделировании рибосомиого белка 7.
3.2. Клонирование рибосомных белков
3.2.1. Клонирование
3.2.2. Клонирование
3.3. Подготовка компетентных клеток и трансформация рекомбинантными плазмидами
3.4. Определение наличия вставки в векторе
3.5. Выделение рибосомных белков 7
3.6. Синтез РНК i vi с фрагментов ДНК, полученных ПЦР.
3.7. Выделение фрагмента рРНК и фрагментов мРНК . i
3.8. Работа с комбинаторной библиотекой РНК.
3.9. Комплексообразование РНК с рибосомным белком.
3 Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РЫК через секвенирование ДНК по Сэнгеру.
3 Реакции радиоактивного мечения олигодсзоксирибонуклеотидов
3 Химическая модификация РНК
3 Картирование модификаций и расщепления РНК, а также контрольное секвенирование
3 УФ индуцируемое сшивание комплекса РНК с белком.
3 Иммобилизация тромбина на активированной сефарозе
3 Работа с комбинаторной библиотекой ДНК
3 Анализ фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле.
3 Разделение цепей ДНК с помощью стрептавидиновых частиц
3 Селсктирование аптамеров к тромбину первым способом.
3 Селекция аптамеров к тромбину вторым способом.
3 Определение степени комплексообразования ДНК с тромбином
3 Рестрикция нуклеиновых кислот.
3 Лигирование обогащенной фракции аптамеров с плазмидными ДНК
3 Секвенирование аптамеров в составе плазмид
3 Дизайн и структура базовых ДНКалтамсров, взаимодействующих с тромбином.
3 Аптамеры к тромбину.
3 Исследования структур аптамеров с помощью метода
кругового дихроизма.
3 Работа с тромбином
3 Методика исследования связывания аптамеров с тромбином
3 Иммобилизация аптамера ЯЕ.
3. Модель аргериального тромбоза у животных.
Список литературы.
Приложение
Список сокращений
Были использованы обозначения, рекомендованные комиссией по
номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и
Международного союза биохимиков I.
дезоксирибонуклеозид5трифосфат пи пара нуклеотидов ак аминокислота кДа килодальтон
7 рибосомиый белок 7 . i
7 рибосомиый белок 7 Т. i,
7 рибосомиый белок 7 В. i
рРНК Фрагмент 3 рРНК К i
мРНК Фрагмент i мРНК . i между цистронами и 7 Малая субчастица рибосом Т. i i оперон стрептомициновый опером
РСА Рентгеноструктурный анализ
ЦР полимеразная цепная реакция
ПААТ полиакриламидный гель
БСА бычий сывороточный альбумин
ДСН додецилсульфат натрия
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
Трис 2амино2гидроксимстил1,3пропандиол
ИГ1ТГ изопропилтиогалактозид
ДМСО диметилсульфоксид
дитиотрейтол
гидроксиэтилпипсразин1этан сульфокислота
X 5бром4хлор3индолилР0галактопиранозид
МЦФ фрагмент мРНК . i между цистронами и 7 рбелки рибосомные белки,
Введение


При использовании иитроцеллюлозных фильтров комплекс аптамера с белком сорбируется на мембране, а несвязавшиеся аптамеры проходят, не задерживаясь. В методе гельэлектрофореза используется различие в подвижности в полиакриламидном геле молекул исходной библиотеки и ее комплексов с мишеныо. Так как РНКДНК аптамеры мечены радиоактивным фосфором, то поведение аптамеров контролируется методом радиоактивных индикаторов. В результате нескольких циклов селекции получается обогащенная фракция аптамеров, которая связывается с молекулоймишеныо на несколько порядков сильнее, чем исходная библиотека сравнивают кажущиеся константы диссоциации полученных комплексов. На сегодняшний день опубликовано много обзоров с детальным описанием всех этапов данного метода 5. Ряд авторов делали попытки исследовать, может ли новая функция быть получена из предсуществующей структуры . М 1лМ
V
и
юо
,г. Ри3. По оси абсцисс показано увеличение информационной сложности. На рисунке представлена вторичная структура каждой серии ГТФсвязывающих алтамеров. Они расположены согласно уменьшению констант диссоциации. Двигаясь слева направо, аптамеры приобретают все болсс сложные вторичные структуры. Звездочками указаны те элементы структуры, которые исходно были включены в комбинаторную библиотеку Ц7. В одном удачном примере была сконструирована библиотека из 2,5 х молекул с внутренним стеблем и стабильной четырехнуклеотидной петлей, фланкированной ю полностью случайными основаниями Частично сконструированная библиотека была смешана с библиотекой, имеющей полноразмерный район со случайной последовательностью 2,5 хм молекул той же длины. Смесь библиотек была подвергнута селекции для высокоаффинного связывания с молекулами СТР . Было получено различных семейств аптамеров с константами диссоциации комплексов с СТР, которые варьировали от 8 мкМ до 9 нМ. Все они были выделены, охарактеризованы и показано, что с усложнением структуры увеличивается сродство к СТР рис. Аптамсрьт, полученные в результате селекции, т. Однако не все нуклеотиды аптамеров полной длины играют главную роль в связывании со своей мишепыо. Аптамер полной длины обычно имеет три функциональных района. Первый находится в контакте с мишеныо, имеет длину н. Нуклеотиды, которые либо связываются с мишенью, либо облегчают связывание алтамера, составляют второй район и являются значимыми нуклеотидами, требуемыми для функционирования алтамера. Как правило, длина таких значимых нуклеотидов составляет н. Третий район включает нуклеотиды, которые не связываются с мишеныо. Они рассматриваются как несущественные. Эту процедуру предпринимают по ряду причин. Вопервых, в некоторых случаях удаление несущественных нуклеотидов может увеличить сродство аптамеров и усилить их связывание с мишеныо , , вероятно, изза уменьшения стерических затруднений. Вовторых, хотя химический синтез олигонуклеотидов и представляет собой хорошо разработанную методику, синтез аптамеров длиннее, чем и. Укорочение аптамеров обычно делается на основе анализа моделированных структур или характеристики сегментов аптамеров. В первом случае используют алгоритмы для теоретического предсказания вторичных структур аптамеров , . Путем сравнения структур выбранных аптамеров выявляют аналогичные мотивы и определяют, какие сегменты аптамеров являются существенными для связывания. Однако современные алгоритмы предсказывают структуру нуклеиновых кислот в отсутствие мишеней. Это корректно не для всех аптамеров, т. Видимо, этот метод будет более широко применяться при укорочении аптамеров, если будут разработаны более усложненные алгоритмы с учетом связывания с мишенями. В основном используется подход, при котором проводят синтез большого числа коротких структур с последующим анализом их сродства к мишеням. Более короткие последовательности легче синтезируются, легче характеризуются фингерпринтом, анализом пограничных районов . Для молекул РНК полез посте таких подходов достаточно спорна, поскольку стоимость химического синтеза последовательностей аптамерных РНК полной длины очень высока.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.263, запросов: 160