Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека

Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека

Автор: Вейко, Наталья Николаевна

Год защиты: 2001

Место защиты: Москва

Количество страниц: 259 с. ил

Артикул: 341753

Автор: Вейко, Наталья Николаевна

Шифр специальности: 03.00.26

Научная степень: Докторская

Стоимость: 250 руб.

1.1. Нерадиоактнвномечсные ДНК зонды для гибридизации
7.7.7. Обзор л итературы.
7.7.2. Задачи исследования.
1.1.3. Синтез и свойства фотоактивируемых арилазидов.
1.1.4. Получение и свойства ДНКзондов.
7.7.5. Использование фотобиотинилированных ДНКзондов.
1.1.5.1. Дот блот и i i гибридизация
1.1.5.2. Количественные методы анализа последовательностей ДИК
1.1.5.3. Зонды на транскрибируемую область рибосомпого повтора
1.2. Особенность фрагментации ТО рДНК при действии реагентов,
индуцирующих в ДНК однонитевые разрывы
1.2.1. ii длины фрагментов рДНК в образцах ДИК, выделяемой из различных тканей и биожидкостей.
1.2.2. Устойчивость ТО рДНК к фрагментации при внесении и в ДНК
однитевых разрывов
1.2.3. Практическое применение свойства устойчивости ТО рДНК к парным разрывам
1.2.3.1. Детекция фрагментов рДНК в сыворотке крови человека в норме и при патологии.
ГЛАВА 2. ОБЩЕЕ ЧИСЛО И ЧИСЛО АКТИВНЫХ КОПИЙ РДНК В
ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА.
2.1. Обзор литературы.
2.7.7. Общее число копий РГ в геноме человека.
2.7.2. Количество копий рДНК в ЯОР хромосом человека
2.1.3. Определение количества активных копий рДНК.
2.1.3.1. Анализ сателлитных ассоциаций, окраска хромосом.
2.1.3.2. Метод непрямой иммунофлуоресценции.
2.1.3.3. Потенциально активные копии РГ млекопитающих.
2.1.4. Задачи исследования
2.2. Число копАй рДНК в геноме человека.
2.2.1. Объекты исследования.
2.2.2. Метод определения числа копий РГ в геноме
2.2.2.1. Выделение ДНК из клеток
2.2.2.2. Измерение концентрации ДНК и ее фрагментация.
2.2.2.3. Контрольные последовательности калибровочные кривые.
2.2.2.4. Условия гибридизации характеристика зондов
2.2.2.5. Дополнительные контрольные эксперименты
2.2.2.6. Число копий РГ в геноме человека.
2.3. Определение числа активных копий рДНК в ст имулированных
лимфоцитах человека
2.3.1. Объекты исследования.
2.3.2 Число активных копий РГ в стимулированных лимфоцитах.
2.3.3. Число неактивных копий РГ, содержащихся в активных и
неактивных ЯОР хромосом.
2.4. Определение относительного количества потенциальноактивных
копий РГ в в клетках человека
2.4.1. Объекты исследования
2.4.2. Определение двух фракций РГ.
2.4.2.1. Кинетика гидролиза ядер лимфоцитов человека рестриктазой .
2.4.2.2. Количественные соотношения между копиями РГ, находящимися в
открытой и закрытой конформации.
2.5. Обсуждение и выводы по главе
ГЛАВА 3. МЕТИЛИРОВАНИЕ ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ РИБОСОМНОГО ПОВТОРА ЧЕЛОВЕКА.
3.1. Обзор литературы
3.1.1. Общие сведения о метилировании ДНК в клетках млекопитающих.
3.1.2. Последствия метилирования ДНК в клетке.
3.1.3. Методы изучения метилирования геномной ДНК.
3.1.4. Метилирование рДНК млекопитающих.
3.1.5. Связь метилирован ип и транскрипции рибосомных генов.
3.1.6. Задачи исследования
3.2. Метилирование ТО рДНК лейкоцитов человека.
3.2.1. Объекты исследования.
3.2.2. Методы изучения метилирования рДНК.
3.2.3. Анализ метилирования ТО рДНК человека с помощью гидролиза рестрикмазой .
3.2.4. Гидролиз ТО рДНК человека рестриктазой
3.2.5. Изучение метилирования ТО рДНК с помощью рестрчктазы i
3.2.6. Количественная оценка метшшрования тотальной ДНК и рДНК
3.2.7. Сравнение результатов цитогенетического анализа РГ и данных о метилировании ТО рДНК
3.3. Метилирование ТО рДНК в различных типах клеток.
3.3.1 Метилирование рДНК в лимфоцитах и лейкоцитах
3.3.2. Метилирование ТО рДНК в сперматозоидах человека
3.3.3. Метшшрования рДНК в различных тканях.
3.4. Обсуждение результатов и выводы но главе 3.
3.4.1. Вариабельность метилирования ТО рДНК человека.
3.4.2. Вариабельность метилирования копий рДНК одного генома.
3.4.3. Сопоставление количеств неактивных и метилированных копий.
3.4.4. Метилирование ТО рДНК в ра зличных типах клеток человека.
3.4.5. Возможный механизм образования паттерна метилирования рДНК.
ГЛАВА 4. ЭЛЕМЕНТЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТО рДНК В КЛЕТКАХ
ЧЕЛОВЕКА.
4.1. Обзор литературы.
4.1.1. Локализация РГ в структурах ядрышка.
4.1.2. Расположение транскрибируемых копий РГ
4.1.3. Взаимодействие рДНК с ядерным матриксом
4.1.4. Конформация потенциальноактивных и неактивных копий РГ.
4.1.5. Задачи исследования
4.2. Досту пность различных участков ТО РГ в клетках и ядрах
человека действию эндонуклеаз и арилазида.
4.2.1. Объекты исследован ня.
4.2.2. гидролиз ТО рДНК в изолированных ядрах лимфоцитов.
4.2.3. гидролиз ТО рДНК в изолированных ядрах фибробластов и
клеток лимфобластоидной линии.
4.2.4. Гидролиз ТО рДНК ядер лимфоцитов ДНКазой 1
4.2.5. Модификация арилазидом ТО рДНК в лимфоцитах и изолированных ядрах
лимфоцитов.
4.3. Прочносвязанные с рДНК белки II человека
4.3.1. Обнаружение прочносвязанных белков
4.3.2. Прочносвязанные с рДНК белки в изолированных ядрах, нуклеоиде и
нуклеопротеиде.
4.3.3. Выделение и частичная характеристика белков, экранирующие
1 в ТО рДНК.
4.3.4. Количество копий РГ с экранированным сайтом 1 при
различных состояниях клетки.
4.4. Расположение метилированных копий РГ в ядрах лимфоцитов
4.5. Обсуждение результатов
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТО
рДНК ЧЕЛОВЕКА.
5.1. Неактивные копии рнбосомных генов.
5.2. Активные потенциально активные копии РГ.
Список цитируемой литературы.
Список сокращений
РГ рибосомные гены РП рибосомный повтор
нетранскрибируемый межгенный спейсер РП основания 5 внешний транскрибируемый спейсср основания 1
3 внешний фанскрибируемый спейсер основания
I 1 внутренний транскрибируемый спейсер
I2 внутренний транскрибируемый спейсер
ПСБ прочно связанные с рДНК белки
КМРГ кластеры молчащих т.е. неактивных рибосомных генов ЯОР ядрышкообразующие районы акроцентрических хромосом ЯОР хромосом, окрашивающиеся азотнокислым серебром БШ больные шизофренией ЗД здоровые доноры
Введение


Методы введения биотина в НК с помощью реакции трансаминирования менее предпочтительны, по двум причинам 1 денатурированные НК хуже хранятся 2 модификация затрагивает экзоцикли ческу ю аминогруппу в 4м положении цитозина, участвующую в образовании водородных связей в двойной спирали ДНК, что сказывается на температуре плавления дуплексов и снижает избирательность зонда в гибридизации. Нам кажется перспективным за основу взять способ мечения с использованием фотобиотина. С целью снижения сорбции биотинилированного зонда на мишени и материале фильтра, необходимо изменить исходную формулу рис. Рис. I1. Структурная формула фотобиотина Фостера . Рис. Общая структурная формула синтезированных арилазидов. Схема использования фотоактивирусмых арилазидов для присоединения маркерных групп к ДНК. М X активированные соединения изотиоцианаты или Ыоксисукцинимидные эфиры биотина, биотинваминокапроновой кислоты, дигогсигенина и флуоресцсииа. С другой стороны, положительный заряд на фотореагенте способствует повышению локальной концентрации арилазида вблизи ДНК при мечении, т. Кроме того, желательно, чтобы фотореагент был многофункциональным, т. ДНК не только биотин, но и другие маркерные группы дигоксигенин, флуоресцеин и т. Перечисленные задачи могут быть решены при использовании двухстадийной схемы введения маркерной группы в ДНК рис. На первой стадии к НК с помощью фогоактивированного арилазида присоединяется первичная аминогруппа. При этом положительный заряд на аминогруппе должен обеспечить достаточную растворимость реагента в буферных растворах и способствовать созданию повышенной локальной концентрации реагента вблизи ДНК. На второй стадии к реакционноспособной аминогруппе могут быть присоединены такие маркерные молекулы, как биотип и дигоксигенин через соответствующие Ноксисукцинимидные эфиры или флуоресцеин и родамин при использовании изотиоцианатов. Таким образом, заряженная аминогруппа блокируется на стадии получения конечного продукта и устраняется возможность неспецифической сорбции зонда за счет дополнительных электростатических взаимодействий. Данная схема имеет преимущество перед одностадийным синтезом и в том, что маркерная молекула не облучается светом, что важно при введении светочувствительных соединений, например, красителей. Кроме того, в разделе описывается обнаруженное в процессе работы необычное свойство последовательности ТО рДНК, которое накладывает определенные ограничения на методы, используемые для анализа РП с применением ДНКзондов. Синтез и свойства фотоактивируемых арилазидов. В отличие от фотобиотина Фостера . Соединения 1 и 3 синтезировали соответственно из парааминобензойной и парааминосалициловой кислот по стандартной методике, включающей получение солей диазония с последующей их реакцией с азидом натрия. Исходным соединением в синтезе арилазида 2, была парааминобеизойная кислота, из которой по известным методикам получали 4амино2нитробензойную кислоту. Вейко и соавтр. Соединения и получали при реакции арилазида соответственно с оксисукцинимидным эфиром биотина или уксусным ангидридом. Изучена способность синтезированных арилазидов , , , и подвергаться фотолизу при облучении видимым и УФсветом. На рис. Ч 4рНСНдКН2 . Рис. Структурные формулы синтезированных арилазидов. В биотин. Ы4азидо2нигробензоил1,7диаминогептана соединение до и после облучения видимым светом. Фотолиз азидов сопровождается значительным уменьшением поглощения в области нм и увеличением поглощения в видимой области. Кинетику фотолиза изучали путем измерения поглощения раствора при А нм в зависимости от времени облучения. В таблице приводятся периоды полураспада арилазидов , и при облучении светом с различными длинами волн. Таблица . Азиды и эффективно разлагаются видимым светом, азид разлагается только при УФоблучении. Так как УФоблучение ДНК приводит к модификации оснований Кочетков и соавт. Было показано, что при фиксированной длине волны скорость фотолиза арилазидов , и мало зависит от среды в интервале , ионной силы ,2 М ЫаС1 и природы буфера ацетат или фосфат натрия. Получение и свойства ДНКзондов. Синтезированные реагенты использовали для получения ДНК, содержащей различные маркерные группы, но схеме, представленной на рис. Данная схема позволяет на основе одного фотоактивируемого арил азида присоединять к ДНК различные маркерные молекулы.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.188, запросов: 145