Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии

Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии

Автор: Коробко, Игорь Викторович

Шифр специальности: 03.00.26

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2009

Место защиты: Москва

Количество страниц: 296 с. ил.

Артикул: 4659281

Автор: Коробко, Игорь Викторович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ.
1. Материалы и методы исследования
1.1. Культуры клеток
1.2. Плазмиды.
1.3. Аденовирусы
1.4. Антитела.
1.5. Ингибиторы, ганциклооир, химиотерапевтические препараты
1.6. Выделение РНК
1.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
1.8. Сайтнаправленный мутагенез
1.9. Вестернблот анализ
1 Картирование сойто инициации транскрипции гена v
1 Клонирование кДНК Рабаптина5 и его изоформ.
1 Двугибридное клонирование и анализ взаимодействия белков в дрожжах
1 АнтиМАКV антитела.
1 АнтиII антитела
1 АнтиРдс антитела.
1 Иммунопреципитация
1 Иммунофлуоресценция.
1 i i x
1 Эндоцитоз а жидкой фазе.
1 Получение линии мышей с направленно нарушенным геном v
1 Анализ транскрипта v у мышей с направленно нарушенным геном v.
1 Образцы тканей
1 Иммуногистохимический анализ
1 Приготовление лизатов тканей опухолей и прилегающих к ним тканей
1 Приготовление образцов для анализа уровней транскриптов.
1 Анализ уровней транскриптов методом полуколичественной ПЦР
1 Анализ активности репортерного гена люциферазы
1 Анализ жизнеспособности клеток линий рака легкого.
1 Другие методы исследования
1 Компьютерный анализ и базы данных.
2. Протеинкиназа V
2.1. Клонирование кДНК v
2.2. V АМРКподобная протеинкиназа
2.3. Функции АМРКподобных протеинкиназ.
2.3.1. Протеинкиназы АМРК.
2.3.2. Протеинкиназы 1.
2.3.3. Протеиникиназа .
2.3.4. Протеиникиназы
2.3.5. Протеинкиназы .
2.3.6. Протеинкиназы I
2.3.7. подобные протеинкиназы
2.4. Протеинкиназа МАКV о развитии и в нервной системе.
2.5. Ген v
2.5.1. Ген v в эволюционном контексте.
2.5.2. Характеристика промотора гена v мыши.
2.5.2.1. Клонирование 5области гена v мыши.
2.Б.2.2. Картирование сайта инициации транскрипции гена v мыши.
2.5.2.3. Анализ промоторной активности 5области гена v мыши
2.Б.2.4. Роль метилированил в регуляции транскрипции гена v
2.6. Внутриклеточная локализация и статус фосфорилирования МАКV
2.6.1. Локализация МАКV на центросоме
2.6.1.1. Характеристика экспрессионных конструкций и антител.
2.6.1.2. Центросомальнан и нуклеоцитоплазматическэя локализация протеинкиназы МАКV
2.6.2. Фосфорилирование протеинкиназы МАКV в клетке
2.7. Потенциальные белкипартнеры по взаимодействию с МАКV.
2.7.1. Функции изолированных потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкинозой МАКV
2.7.1.1. Протокадгерин
2.7.1.2. белок I.
2.7.1.3. Перифилин1.
2.7.1.4. Аспарагинил гидроксилаза I
2.7.2. Робаптин5 и его изоформы
2.7.2.1. Клонирование изоформ Рабаптина
2.7.2.2. Рабаптин5 и его изоформы.
2.7.2.3. Взаимодействие протеинкиназы МАКV с Рабаптином5 и его изоформами
2.7.3. МАКV как регулятор эндоцитоза.
2.8. Мыши с направленнонарушенным геном v.
2.8.1. Дизайн конструкции для гомологичной рекомбинации
2.8.2. Получение клонов эмбриональных стволовых клеток с направленно нарушенным аллелем гена v.
2.8.3. Получение и характеризация линии мышей с направленно нарушенным геном v.
2.9. Роль МАКV в поддержании жизнеспособности клеток
2.9.1. Клетки с индуцибельной экспрессией МАКV кок модельная система
2.9.2. V 2индуцированная цитотоксичность
2.9.3. Влияние МАКV на дифференцировку клеток РСТеЮп по нейрональному пути
2.9.4. МАКV и клеточный ответ на компоненты внеклеточного матрикса
2 Продукция МАКV в опухолях молочной железы человека
3. Исследование изменения экспрессии генов при немелкоклеточном раке легкого.
3.1. Экспрессия v при немелкоклеточном раке легкого
3.2. Супрессор сигнального пути I1.
3.2.1. сигнальный путь.
3.2.2. Ген I
3.2.3. Белок I
3.2.4. I1 как ингибитор сигнального пути.
3.2.5. Экспрессия I1 в опухолях
3.2.6. I1 как мишень для противоопухолевой терапии.
3.2.7. Экспрессия I1 при немелкоклеточном раке легкого.
3.3. Супрессор опухолевого роста
3.3.1. Ген и траненрипт 4.
3.3.2. 4, апоптоз и контроль пролиферации клеток.I
3.3.3. Экспрессия 4 в опухолях
3.3.4. 4 и канцерогенез.
3.3.5. Экспрессия 4 как молекулярный параметр опухолей
3.3.6. Молекулярные механизмы действия
3.3.7. Экспрессия 4 при немелкоклеточном раке легкого.
4. Супрессор опухолепого роста 4 как мишень для противоопухолевой терапии
4.1. Регуляция экспрессии и активности
4.1.1. Регуляция транскрипции 4.
4.1.2. Регуляция трансляции 4.
4.1.3. Регуляция стабильности белка 4.
4.1.4. Внутриклеточная локализация
4.1.5. Регуляция активности 4 фосфорилированием.
4.2. Восстановление экспрессии 4 как противоопухолевое воздействие
4.2.1. Эффект трансгенной экспрессия 4 в линиях клеток рака легкого.
4.2.2. Белок 4 подвержен I деградации в клетках линии I
4.2.3. Роль серина7 4 в деградации 4.
4.2.4. Продукция белка 4,,7 позволяет восстановить активность 4 в клетках линии I
5. Экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа для терапии опухолей.
5.1. Концепция отечественного противоопухолевого средства на основе промотора гена и тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа
5.1.1. Промотор гена
5.1.2. Тимидинкиназо вируса простого герпеса 1 типа.
5.1.3. Рекомбинантные репликативнодефектные аденовирусы как система доставки.
5.1.4. Экспрессионные модули на основе фрагмента промотора гена и тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа
5.2. Эффективность экспрессионных модулей i vi
5.2.1. Эффективность плазмидных конструкций.
5.2.2. Эффективность аденовирусных препаратов V и VV
5.2.3. Эффективность совместного действия аденовирусных препаратов и химиотерапевтических противоопухолевых средств
6. Повышение эффективности противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативйодефектных аденовирусов.
6.1. Селекция позитивных опухолей.
6.2. Повышение специфичности экспрессии трансгена в опухолевых клетках
6.3. Использование и для увеличения продукции белков, кодируемых репликативнодефектными аденовирусами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Для аффинной очистки антител, белок 4, иммобилизованный на глутатионсефарозе, протсолигически расщеплялся тромбином i, и полученные фрагменты рекомбинантного белка 4 после удаления тромбина на 7аминобензамидинагарозе i ковалентно иммобилизовали на активированной ссфарозс 4В ii . Для иммунопреципитации клетки лизировали в буфере, содержащем 1х триссолевой буфер i, 1 , Германия, 0. X0 i, коктейли ингибиторов протеаз без ЭДТА и фосфатаз i, 0. М ЕГТА и 1 мМ с последующим центрифугированием для осаждения дебриса. Для очистки белков с эпитопом использовали 2 аффинный гель i. Для промывки аффинного матрикса после связывания использовали буфер для лизиса. Клетки фиксировали в 3 растворе параформальдегида в с последующей инкубацией в мМ хлориде аммония и пермеабилизацней в 0. X0, или в меганоле при С. Неспсцифическое связывание блокировали 3 раствором сухого обезжиренного молока в с 0. Инкубацию с первичными и вторичными антителами проводили в блокирующем буфере. Окрашенные препараты заключат в Мовиол i. Изображения получали на конфокальном микроскопе i, Германия или i, i, Великобритания с объективами хбЗ или х в режиме последовательного сканирования по каналам. Технология i i x , опосредованный рекомбиназой обмен кассет был описан ранее i . Клетки линии В. МР0 трансфицировали плазмидой 3 и отбирали клоны по устойчивости к 8. В полученных клонах проводили анализ активности Ргалактозидазы i, , и клон с наибольшей активностью был отобран для дальнейших экспериментов. Для обмена рекомбинационными кассетами клетки котрансфицировали плазмидой для продукции рекомбиназы , и плазмидой с рекомбинационной кассетой 3, 3i или 3, и пулы клеток с рекомбинированной экспрсссионной кассетой отбирали но утере тимидин киназы вируса простого герпеса в присутствии гапцикловира. После рекомбинации с экспрессионной кассетой клетки линии ВМР0 инкубировали с пероксидазой хрена в ростовой среде и использовали для приготовления экстракюв как описано в i . Активность пероксидазы в экстрактах определяли с помощью хромогенного субстрата офенилендиамина i и нормировали на концентрацию белков в экстракте, измеренному с помощью i i. Измерения проводили минимум 3 раза, данные приведены как среднее значение стандартное отклонение. Мерцалов и др. Клетки трансфицировали с помощью электропорации линеаризованной но сайту узнавания рестрикционной эндонуклеазы плазмидой для гомологичной рекомбинации с целью дслеции экзона 4 гена v. Отбор клонов проводился в присутствии 8 позитивная селекция и ганцикловира негативная селекция. Из клонов выделяли геномную ДНК и проводили анализ гомологичной рекомбинации короткого плеча с помощью ПЦР с праймерами 1, отжигающимся выше 5конца последовательности короткого плеча, и псоВ, находящегося в гене неомицин фосфотрансферазы Таблица 1. Рис. Анализ гомологичной рекомбинации длинного плеча проводился с помощью Саузсрнблот гибридизации геномной ДНК клонов, ращеплениой рестрикционной эндонуклеазой I, с Рмеченным зондом см. Рис. При этом для аллеля дикого типа выявляется фра мент размером . Рис. СВ для получения химерных мышей выполнено М. В. Прыжковой, ИБГ РАН. Присутствие нарушенного аллеля v и аллеля дикого типа v выявляли с помощью ПЦР на матрице геномной ДНК мышей с праймерами МКК, МК. А и пеоВ таблица 1. Рис. ПЦР проводилась в объеме мкл в присутствии 1 мМ 2 в буфере для ДНКполимеразы, 0. М , 2 ед. ДНКполимеразы при циклах С, с С, с С, с. II Ivi на матрице свободной от Д1К тотальной РНК со случайной олигонуклеотидной затравкой. ПЦР проводилась с праймерами и МКОА Таблица 1. Ivi при циклах С, с С, с. Образцы тканей немелкоклеточного рака легкого НМКРЛ человека были получены в ходе хирургических операций. Все пациенты с IIII стадией рака наблюдались в РОНЦ им. Н. И. Блохина РАМН И. Б. Зборовская, А. К. Аллахвердиев. Пациенты не подвсргатись ранее химиотерапии и радиотерапии. Образцы опухолевых тканей и прилежащих к опухоли нормальных тканей легких разделяли на две порции. Одна часть быстро замораживалась в жидком азоте для последующего выделения РНК и приготовления белковых экстрактов, а другая была подвергнута гистологическому анализу. Образцы раковых тканей содержали не мснсс раковых клеток.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.179, запросов: 145