Стабильность бифункциональных векторов у дрожжей сахаромицетов

Стабильность бифункциональных векторов у дрожжей сахаромицетов

Автор: Куприна, Наталия Юрьевна

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Кандидатская

Год защиты: 1984

Место защиты: Ленинград

Количество страниц: 127 c. ил

Артикул: 3432535

Автор: Куприна, Наталия Юрьевна

Стоимость: 250 руб.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Обзор литературы
I. Векторы дрожжей в изучении организации репликативного аппарата у дрожжейсахаромицетов .
1.1. Векторы дрожжейсахаромицетов
1.1.1. Интегративные векторы .
1.1.2. Векторы, способные к автономной репликации . .
1.1.2.1. Векторы эписомного типа
1.1.2.2. Репликативные векторы .
1.1.2.3. Центромерсодержащие векторы .
1.1.2.4. Линейные векторы
З. Проблема определения копийности автоном
норешшцирующихся векторов дрожжей .
1.2. Организация последовательностей ДНК у дрожжей, функционально значимых для репликации
1.2.1. Свойства хромосомных репликаторов дрожжей .
1.2.2. Репликатор плазмидной омийронной ДНК . .
1.2.3. Центромерные последовательности хромосом дрожжей.
1.3. Заключение. Постановка задачи исследования . . Экспериментальная часть
2. Материалы и методы
2.1. Штаммы микроорганизмов.
2.2. Среды и условия культивирования микроорганизмов .
2.3. Генетический анализ штаммов дрожжей
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Выделение бактериальных плазмид
2.4.2. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей . .
2.4.3. Выделение общей ДНК из дрожжей .
2.5. Анализ ДНК.
Стр.
2.5.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрик
ции . .
2.5.2. Лигирование фрагментов ДНК с помощью ДНКпигазы фага Т4 .
2.5.3. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле .
2.6. Генетическая трансформация. .
2.6.1. Трансформация бактерий.
2.6.2. Трансформация дрожжей.
2.6.2.1, Трансформация дрожжей с использованием сферопластов
2.6.2.2. Трансформация дрожжей с использованием интактных клеток .
2.6.3. Определение митотической стабильности
гибридных плазмид
3. Результаты исследований.
3.1. Конструирование гибридных центромерных плазмид, несущих различные репликаторы дрожжей
3.1.1. Конструирование плазмиды У1РСЕ1гз , содержащей хромосомный репликатор арпЗ . .
3.1.2. Конструирование плазмиды уерсеез , содержащей репликатор омикронной ДНК .
3.2. Митотическая стабильность гибридных центромерных плазмид в различных штаммах дрожжей
3.3. Определение числа копий центромерных плазмид в трансформированной клетке дрожжей
3.4. Генетическое исследование признака стабильного поддержания центромерной плазмиды Иссенз ,
несущей репликатор рДНК, в штамме 1АП . .
3.5. Исследование поведения гибридной плазмиды, несущей репликатор рДНК у моносомиков по хромосоме Г
3.6. Математическая модель, описывающая потерю центромерных плазмид при митотических делениях трансформантов дрожжей.
3.7. Конструирование двурепликаторннх центромерных
плазмид и изучение их свойств .
3.7.1. Конструирование плазмид, содержащих два
репликатора рДНК дрожжей.
3.7.2. Конструирование плазмиды, несущей тандемную дупликацию хромосомного репликатора .
3.7.3. Митотическая стабильность центромерных плазмид, содержащих два репликатора
3.7.4. Митотическая стабильность центромерной плазмиды, содержащей два хромосомных репликатора арп I
3.7.5. Генетический анализ трансформантов дрожжей, содержащих двурепликаторные центромерные плазмиды
3.8. Изучение клеточирго контроля функции центромерного локуса 3 у дрожжей
3.8.1. Отбор мутанта с нестабильным поддержанием центромерных плазмид
3.8.2. Генетический анализ признака пониженной митотической стабильности центромерных плазмид в штамме .
3.8.3. Митотическая стабильность хромосом у щгтанта 2i8.
4. Обсуждение полученных результатов.
4.1. Использование гибридных центромерных плазмид для изучения свойств хромосомных репликаторов дрожжей .
4.2. Проблема создания амплифицибельных векторов у дрожжей
4.3. Нестабильность центромерных векторов и их кольцевая структура
4.4. Изучение работы центромерных лонусов дрожжей с использованием гибридных плазмид.
Выводы
Литературный указатель.
Принятые сокращения
арп автономнореплицирующаяся последовательность
А аденин
Г уанин
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
оДНК Омикронная дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЭГ полиэтиленгликоль
РНК рибонуклеиновая кислота
рРНК рибосомальная рибонуклеиновая кислота
Саркозил додецилсаркозинат натрия
Т тимин
ТЕ триснС1 0, М ЭДТА 0,1 шЫ содержащий буфер 7,
т.п.о. тысяч пар оснований
Трис триоксиметиламиноме тан
Ц цитозин
ЭДТА этилендиаминотетрацетат
ЭтБр бромистый этидий
ВВЕДЕНИЕ
Пекарские дрожжисахаромицеты относятся к груше наиболее хорошо изученных эукариотических объектов. В настоящее время у дрожжей охарактеризовано более 0 генетических локусов на хромосомах и достаточно полно изучена организация метаболических путей 7. Как известно, дрожжисахаромицеты являются одним из классических объектов исследования биохимических процессов.
Прогресс исследований дрожжей последних лет связан с разработкой на этом объекте новых методов молекулярного клонирования. Результаты, полученные при использовании новых методов, значительно расширили наши представления об организации генома у высших. Методы молекулярного клонирования на дрожжах открыли также путь использования дрожжей для решения некоторых прикладных вопросов производства биологически активных полипептидов и противовирусных вакцин. Использование дрожжей для создания штаммовпродуцентов практически важных полипептидов, по сравнению с бактериями, в частности Е.соИ , имеет два важных преимущества. Прежде всего дрожжисахаромицеты не патогенны для человека. Не менее важно, что дрожжи это объект, освоенный микробиологической промышленностью.
Генноинженерные эксперименты на дрожжах проводят с использованием специально сконструированных гибридных плазмидвекторов, функция которых заключается в переносе интересующих нас генов в рецшгаентные клетки дрожжей. К настоящему времени создана целая серия векторов, имеющих в целом сходную схему организации. Именно с использованием таких векторов удалось создать штаммы дрожжей продуценты интерферонов человека , соматотропного гормона и белка вируса оболочки гепатита В чело
века, необходимого для получения вакцин 6.
Несмотря на большие достижения в разработке методов молекулярного клонирования на клетках дрожжей проблема переноса генов в дрожжевую клетку не является окончательно решенной. Главным недостатком векторов, используемых для трансформации дрожжей является их высокая нестабильность. Самые стабильные векторы дрожжей, сконструированные на основе центромерных локусов хромосом, утрачиваются трансформированной клеткой с частотой на клеточную генерацию . Это означает, что при культивировании трансформантов в неселективных условиях в течение генераций доля клеток, сохранивших вектор, будет составлять в популяции всего лишь несколько процентов. Для сравнения можно отметить, что векторы у .i утрачиваются с частотой
, 3, таким образом их стабильность выше более
чем на порядков стабильности векторов дрожжей
Нель настоящего исследования проанализировать основные причины нестабильности векторов у дрожжейсахаромицетов и попытаться найти возможные пути для стабилизации векторов
Актуальность


Несмотря на большие достижения в разработке методов молекулярного клонирования на клетках дрожжей проблема переноса генов в дрожжевую клетку не является окончательно решенной. Главным недостатком векторов, используемых для трансформации дрожжей является их высокая нестабильность. Самые стабильные векторы дрожжей, сконструированные на основе центромерных локусов хромосом, утрачиваются трансформированной клеткой с частотой на клеточную генерацию . Это означает, что при культивировании трансформантов в неселективных условиях в течение генераций доля клеток, сохранивших вектор, будет составлять в популяции всего лишь несколько процентов. Для сравнения можно отметить, что векторы у . Актуальность исследования проблемы нестабильности векторов у дрожжей диктуется тем, что к настоящему времени в литературе не имеется исследований, посвященных изучению причин митотической нестабильности векторов у дрожжей. Научная новизна, В работе впервые показано, что основная причина утраты клеткой дрожжей автономнореплицирующихся векторов связана с неупорядоченной сегрегацией. Установлено также, что векторы репликативного типа могут утрачиваться клеткой вследствие дефекта репликации. Показано также, что стабильность вектора может определяться особенностями клетки реципиента. Практическая значимость. Сконструированные в настоящей работе векторы дрожжей могут быть использованы для клонирования в клетках дрожжейсахаромицетов различных генов, в частности, генов, контролирующих биологически активные полипептиды, имеющие практическое значение. Разработанные в настоящей работе методы открывают новые пути для исследования фундаментальных проблем изучение механизмов репликации и сегрегации хромосом у эукариот. В экспериментах по генной инженерии дрожжей используют специально сконструированные гибридные плазмидывекторы. Создание системы векторного переноса у дрожжей существенно отличалось от создания аналогичной системы у бактерий. У дрожжей не известно генетически маркированных плазмид. Единственная многокопийная плазмида дрожжей омикронная ДНК оДНК является криптической плазмидой, иначе говоря ее наличие в клетке не соцровондается какимлибо фенотипическим проявлением. Именно поэтому конструирование векторов дрожжей шло по пути выделения из генома дрожжей индивидуальных генов, комплементирующих мутации ауксотрофности дрожжей по некоторым аминокислотам и основаниям и объединения этих генов с различными репликонами 3, , . Существующие в настоящее время векторы у дрожжей разделяют на несколько классов. Это разделение обусловлено наличием в данном векторе последовательности ДНК, обеспечивающей ее репликацию. Все сконструированные векторы дрожжей содержат также какуюнибудь бактериальную плазмиду, что обеспечивает поддержание вектора в клетках бактерий. Именно поэтому векторы дрожжей называют бифункциональными, т. Поддержание бифункциональных векторов в клетках дрожжей может обеспечиваться двумя способами. Общее название этой группы векторов автономнореплицирующиеся. Рассмотрим свойства этих двух типов векторов, оба из которых в настоящее время используются в экспериментах по изучению организации генетического аппарата у дрожжей и клонированию генов полипептидов, имеющих практически важное значение. I.I. I.I. I. Интегративные векторы. Схема типичного интегративного вектора представлена на рис. Интегративный вектор состоит из бактериальной плазмида, обеспечивающей его поддержание в клетках . В качестве селектируемого маркера используются проклонированные индивидуальные гены дрожжей, имеющие фенотипическое проявление. Наиболее часто в качестве селектируемых маркеров используются гены дрожжей, способные к экспрессии в клетках . Так, например, ген 2 дрожжей, кодирующий изопропилмалатдегидрогеназу, комплементирует мутацию у . Ген I3 дрожжей, кодирующий имидазолглицерофосфатдегидратазу, комплементирует мутацию i у . ЮО и т. В таблице I приведен список генов дрожжейсахаромицетов, функционально экспрессирующихся в клетках . Эти гены наиболее часто используют для маркировки векторов дрожжей. Все указанные в таблице I гены не содержат интронов и, как было показано, их экспрессия в клетках .

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.206, запросов: 145