Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов

Новые технологии детекции точечных мутаций и анализа полиморфизма повторяющихся последовательностей геномов

Автор: Шилов, Илья Александрович

Шифр специальности: 03.00.23

Научная степень: Докторская

Год защиты: 2006

Место защиты: Москва

Количество страниц: 283 с. ил.

Артикул: 3319626

Автор: Шилов, Илья Александрович

Стоимость: 250 руб.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Роль точечных мутаций в патогенезе различных заболеваний человека
1.1.1. Мутации в генах факторов II, V свертываемости крови, метилентетрагидрофолатредуктазы человека и их связь с предрасположенностью к тромбозам и гипергомоцистеинемии
1.1.2. Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии
1.1.3. Мутации в генах рецептора витамина БЗ, а1коллагена типа 1, эстрогенового
рецептора а человека и их связь с предрасположенностью к остеопорозу
1.2. Современные методы детекции точечных мутаций.
1.2.1. Метод детекции точечных мутаций, основанный на удлинении праймера на
один нуклеотид
1.2.1.1. Анализ точечных мутаций с помощью капиллярного электрофореза
1.2.1.2. Анализ точечных мутаций с помощью флуоресцентной поляризации
1.2.1.3. Анализ точечных мутаций с помощью массспектрометрии.
1.2.2. Метод детекции точечных мутаций на основе полимеразной цепной реакции
с детекцией в режиме реального времени
1.2.3. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспецифического олигонуклеотидного лигирования.
1.2.4. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспецифичеекой гибридизации олигонуклеотидов
1.2.5. Методы детекции точечных мутаций, основанные на анализе конформацион
ного полиморфизма ДНК
1.2.5.1. Гетеродуплексный анализ.
1.2.5.2. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов
1.2.6. Методы детекции точечных мутаций, основанные на использовании эндонуклеаз
1.2.6.1. Аллельспецифический анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции.
1.2.6.2. Анализ с использованием эндонуклеаз, специфичных к неспаренным нуклеотидам в ДНК
1.2.7. Метод детекции точечных мутаций на основе аллельспецифической полимеразной цепной реакции
1.2.8. Практическая реализация технологии детекции точечных мутаций
1.2.8.1. Наборы реагентов, основанные на удлинении праймера на один нуклеотид.
1.2.8.2. Наборы реагентов, основанные на полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени.
1.2.8.3. Наборы реагентов, основанные на использовании аллельспецифической гибридизации олигонуклеотидов
1.2.8.4. Наборы реагентов, основанные на использовании эндонуклеаз и ферментов репарации
1.2.8.5. Наборы реагентов, основанные на аллельспецифической полимеразной
цепной реакции.
1.3. Современные методы идентификации геномов ДНКтипирования
1.3.1. Метод прямого секвенирования полиморфных участков генома
1.3.2. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПДРФ.
1.3.3. Генетическое типировалие с использованием праймеров произвольной первичной структуры.
1.3.4. Генетическое типирование с использованием геномных фингерпринтов
1.3.5. Микросателлитный анализ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы и материалы.
2.2. Приборы и методы.
2.3. Общие методики.
2.3.1. Ферментативное введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды
2.3.2. Реакция химической модификации ДНК.
2.3.3. Определение активности Ш ДНКлигазы
2.3.4. Определение активности термостабильной структуроспецифичекской эндонуклеазы С1еауаяе.
2.3.5. Проведение реакции лигирования на матрице и лигазной цепной реакции
ЛЦР.
2.3.5.1. Проведение лигирования на матрице и ЛЦР с радиоактивной детекцией продуктов реакции.
2.3.5.2. Проведение ЛЦР с флуоресцентной детекцией продуктов реакции
2.3.5.3. Проведение ЛЦР с колориметрической детекцией продуктов реакции
2.3.6. Проведение ПЦР с твердофазной детекцией продуктов реакции
2.3.7. Выращивание растений.
2.3.8. Выделение геномной ДНК.
2.3.8.1. Выделение ДНК с использованием протеиназы К и фенольной экстракции.
2.3.8.2. Выделение ДНК с использованием сорбента СЬе1ех 0.
2.3.8.3. Выделение ДНК с помощью силикагелевого сорбента
2.3.8.4. Выделение ДНК из растений СТАВметодом
2.3.9. Аллельспецифическая полимеразная цепная реакция.
2.3 Амплификация фрагментов ДНК, содержащих микросателлитные последовательности
2.3 Электрофорез в агарозном геле.
2.3 Электрофорез в полиакриламидном геле
2.3 Визуализация ДНК в полиакриламидном геле с помощью нитрата серебра.
2.3 Капиллярный электрофорез
2.3 Приготовление стандартов длины для капиллярного электрофореза.
2.3 Анализ флуоресцентномеченых фрагментов ДНК на автоматическом анализаторе xII
2.3 Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК.
2.3 Трансформация клеток . i и анализ клонов
2.3 Выделение плазмидной ДНК
2.3 Проведение ферментативных реакций
2.3 Секвенирование ДНК методом Сэнгера.
2.3 Анализ нуклеотидных последовательностей
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка новых подходов для детекции точечных мутаций
3.1.1. Исследование возможности применения лигазной цепной реакции ЛЦР для детекции точечных мутаций.
3.1.1.1. Проблема неспецифического лигирования
3.1.1.2. Повышение точности лигирования с использованием структуро
специфической эндонуклеазы v.
3.1.1.3. Разработка системы детекции продуктов ЛЦР.
3.1.1.3.1. Исследование возможности флуоресцентной детекции продуктов ЛЦР
после сорбции их на твердой фазе.
3.1.1.3.2. Колориметрическая детекция продуктов ЛЦР
3.1.1.3.3. Система детекции точечных мутаций модифицированным методом ЛЦР
3.1.2. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллельспецифической ПЦР ЛСПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК.
3.1.2.1. Разработка методологии конструирования аллельспецифических праймеров для АСПЦР в сочетании с капиллярным электрофорезом
3.1.2.2. Создание систем детекции мутаций С0А и в А в генах факторов И и V свертываемости крови человека С7Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы СТ, ТИС и в6А в гене ангиотензиногена ОТ в гене а1коллагена типа I А в гене рецептора витамина ЭЗ и Т8С и А в гене эстрогенового рецептора а человека методом АСПЦР
3.1.2.2.1. Дизайн праймеров и оптимизация условий АСПЦР.
3.1.2.2.2. Анализ продуктов АСПЦР с помощью автоматических анализаторов
ДНК с флуоресцентной детекцией.
3.1.2.2.2.1. Современные системы для автоматического анализа флуоресцентномеченых фрагментов ДНК
3.1.2.2.2.2. Создание отечественного генетического анализатора Мультиген и его
использование для анализа точечных мутаций
3.1.2.3. Концепция создания наборов реагентов для дегекции точечных мутаций
3.2. Разработка подходов к стандартизации технологий генотипирования,
основанных на анализе полиморфизма микросателлитов.
3.2.1. Концепция стандартизации технологии молекулярногенегической идентификации личности.
3.2.1.1. Принципы создания наборов реагентов для идентификации личности
3.2.1.2. Автоматизация анализа идентификации личности с использованием генетического анализатора Мультиген.
3.2.2. Разработка и стандартизация технологий генотипирования растений
3.2.2.1. Исследование генетического разнообразия растений рода методом микросателлитного анализа.
3.2.2.1.1. Выбор локусов для генотипирования растений рода
3.2.2.1.2. Исследование межвидовой и внутривидовой вариабельности растений
рода
3.2.2.1.3. Исследование полиморфизма генома картофеля методом
микросателлитного анализа.
3.2.2.2. Исследование генетического разнообразия растений рода i.
3.2.2.2.1. Выбор локусов для микросателлитного анализа растений рода i
3.2.2.2.2. Микросателлитный анализ видов и разновидностей i и родственных представителей семейства i.
3.2.2.2.3. Исследование интрогрессии фрагментов геномов А, В и С i в межвидовые и межродовые гибриды.
3.2.2.2.4. Исследование природы полиморфизма микросателлитных локусов
геномов А, В и С i.
3.2.2.3. Практическое применение технологии микросателлитного анализа в селекции
3.2.2.3.1. Определение сортовой подлинности образцов картофеля
3.2.2.3.2. Различение близкородственных сортов рапса .
3.2.2.3.3. Контроль интрогрессии генетического материала от родительских форм в гибриды.
3.2.2.3.3.1. Оценка эффективности передачи генетического материала при межвидовой гибридизации картофеля
3.2.2.3.3.2. Исследование интрогрессии аллельных форм микросателлитных
локусов листовых овощных сортов В.г ара в их гибриды
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Также есть данные о том, что полиморфизм С7Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы играет роль в патогенезе рака желудка и ассоциирован с наследственной предрасположенностью к поражению коронарных артерий . В целом, вышеописанные мутации наблюдались у пациентов, страдающих тромбозами 4. Для обнаружения трех вышеописанных полиморфизмов в генах человека применяются методы, основанные на удлинении праймера с помощью одного нуклеотида , аллельспецифической полимеразной ценной реакции ПЦР с последующей детекцией в полиакриламидном геле ПААГ 4 и с помощью капиллярного электрофореза , а также ПЦР с детекцией в реальном времени и с детекцией на основе анализа кривых плавления . Рядом зарубежных фирм Тш ii . Мутации в гене ангиотензиногена человека и их связь с предрасположенностью к первичной гипертонии и преэклампсии. К увеличению или понижению последнего может приводить стимулирование или ингибирование этой системы. Таким образом, изменения в генах любого из компонентов этой системы могут быть причиной предрасположенности к первичной гипертонии . Основным компонентом системы РАС является гормон ангиотензин II, который увеличивает кровяное давление, вызывая сужение сосудов, и является при этом самым сильнодействующим из известных сосудистоактивных гормонов . Известно, что увеличение АСТ в плазме приводит к повышению концентрации сосудосужающего гормона ангиотензина II, и, как следствие, к увеличению кровяного давления . Всего в гене АСТ известно полиморфизмов Табл. Табл. Молекулярные варианты гена ангиотензиногена . Солтлейк Сити г. Точка отсчета сайт инициации транскрипции. В г. Солтлсйк Сити США группа больных гипертонией состояла из человек и контрольная группа из человек. В г. Париже Франция группа больных человека и контрольная группа человек. Как видно из Табл. Большинство из этих полиморфизмов являются молчащими. Наиболее изученными и значимыми являются три полиморфизма два из них расположены в экзоне 2 варианты 7 и 9 в Табл. Они приводят к замене 5го аминокислотного остатка метионина на треонин М5Т и 4го аминокислотного остатка треонина на метионин Т4М . Третий полиморфизм находится в промоторной области гена вариант 5 в Табл. Предполагают, что аллель 5Т неравновесно сцеплен с аллелями 4М и 6А. Только 1 женщин, несущих аллель 5Т, не имеют бА мутации в промоторной области гена . Самой изученной мутацией гена является М5Т. Для европейской популяции частота ее встречаемости составляет и коррелирует с увеличением систолического и диастолического давлений . Обнаружена связь М5Т и 6 полиморфизмов с первичной гипертонией . Для некоторых популяций связь с первичной гипертонией была найдена для каждой из двух мутаций М5Т и Т4М по отдельности . Механизм влияния данных мутаций на увеличение кровяного давления пока не ясен, но известно, что мутация в 5м кодоне ассоциирована с увеличением уровня в плазме , , и это влияние опосредовано тем, что 5Таллель находится в неравновесной сцепленности с бАаллелем, который в свою очередь, как полагают, влияет на увеличение эффективности транскрипции гена , . Это и приводит к повышению уровня в плазме. АбТ, поскольку альдостсрон является одним из регуляторов транскрипции этого гена. Предполагают, что в силу своей отдаленности от промоторной области, мутация в 5м кодоне не может иметь значительного влияния на транскрипцию гена, а, следовательно, скорее всего, является маркером, сцепленным с другими мутациями, существенными для проявления первичной гипертонии ,. Полиморфизмы А и М5Т ассоциированы также с предрасположенностью к преэклампсии , , которая представляет собой патологическое состояние, проявляющееся в неконтролируемом повышении давления и отечности при беременности. Рис. Карга гена человека и области локализации мутаций, приведенных в Табл. Экзоны гена представлены в виде прямоугольников, промоторная область на показана ниже. На ней обозначены некоторые регулирующие транскрипцию элементы ТАТА один из промоторных элементов предполагаемый регуляторный элемент, взаимодействующий с альдостероном регуляторный элемент, взаимодействующий с эстрогеном, регуляторный элемент, взаимодействующий с тиреоидным гормоном. Цифрами отмечены мутации, представленные в Табл.

Рекомендуемые диссертации данного раздела

28.06.2016

+ 100 бесплатных диссертаций

Дорогие друзья, в раздел "Бесплатные диссертации" добавлено 100 новых диссертаций. Желаем новых научных ...

15.02.2015

Добавлено 41611 диссертаций РГБ

В каталог сайта http://new-disser.ru добавлено новые диссертации РГБ 2013-2014 года. Желаем новых научных ...


Все новости

Время генерации: 0.196, запросов: 145